Единая методологическая основа для исследования везикулярной шванномы

Summary

Цель этого протокола состоит в том, чтобы наметить сбор и обработку человеческих хирургических образцов для нескольких нисходящих приложений в вестибулярной шванноме и исследованиях клеток Шванна.

Abstract

Вестибулярные шванномы являются наиболее распространенными новообразованиями угла мозжечка, составляя 6-8% всех интракраниальных ростков. Хотя эти опухоли вызывают сенсорную потерю слуха у 95% пациентов, молекулярные механизмы, лежащие в основе этой потери слуха, остаются неуловимыми. В этой статье описываются этапы, установленные в нашей лаборатории для облегчения сбора и обработки различных первичных образцов тканей человека для последующих исследований, интегральных для изучения вестибулярных шванномов. В частности, эта работа описывает унифицированную методологическую основу для сбора, обработки и культивирования клеток Шванна и шванномы из хирургических образцов. Это интегрировано с параллельными этапами обработки, которые сейчас считаются необходимыми для текущих исследований: сбор опухолей и нервных секретов, сохранение РНК и экстракция белка из собранных тканей, фиксация ткани для подготовки секций,D воздействие первичных клеток человека на адено-ассоциированные вирусы для применения в генной терапии. Кроме того, в этой работе подчеркивается трансбрабиринтный хирургический подход, чтобы собрать эту опухоль как уникальную возможность получить сенсорный эпителий человека из внутреннего уха и перилимфа. Предусмотрены советы по улучшению качества эксперимента и выделены общие проблемы.

Introduction

Vestibular schwannomas (VS) являются наиболее распространенными новообразованиями угла мозжечка, диагностированными в 1 из каждых 100 000 особей. Хотя они и не являются метастатическими, эти опухоли серьезно влияют на качество жизни пациента ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Пострадавшие люди обычно живут с потерей слуха, тиннитусом и чувством слуховой полноты. Симптомы становятся все более истощающими, когда опухоль растет, вызывая проблемы с балансом, лицевой паралич и ухудшение функций других черепных нервов. Также могут возникнуть опасные для жизни осложнения, связанные с компрессией мозга.

Варианты управления для ВС в основном ограничены внимательным ожиданием статических опухолей и стереотаксической лучевой терапии или хирургической резекцией для роста опухолей <sUp class = "xref"> 8. Хирургическое удаление этих опухолей в научно-исследовательских больницах дает возможность приобретать и анализировать свежую опухолевую ткань, собранную во время операций пациента. Один конкретный хирургический подход к ВС, трансабиринтная резекция, может даже предложить доступ к ценному человеческому сенсорному эпителию из внутреннего уха и перилимфа.

Поскольку VS возникают из периферического сенсорного нерва ( т. Е. Вестибулярного нерва), важно сравнить VS-ассоциированные наблюдения с данными, полученными из соответствующего контрольного нерва, например, у человека с большим аурикулярным нервом (GAN). Здоровые ГАН регулярно жертвуют при паротидэктомии или диссекции шеи и могут использоваться в качестве надежных моделей для здоровой физиологии клеток Шванна ⁹ .

Поскольку нет лекарств, одобренных FDA для лечения или профилактики спорадических ВС, крайне важно, чтобы исследователи выяснили основные молекулярные мехиЧтобы определить терапевтические цели. Белки, которые, как было показано, играют роль в патогенезе VS, включают в себя мерлин, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), циклооксигеназу 2 (COX-2), ядерный фактор каппа B (NF-κB), фактор некроза опухолей альфа (TNF-альфа) , Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и связанные сигнальные молекулы ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} .

Недавние достижения расширили и улучшили протоколы сбора, обработки, культивирования и последующего исследования первичных вестибулярных шванномов человека и здоровых нервных тканей ^{18 , 19} . Однако большинство существующих протоколов предназначены для( Например, только клеточная культура). В этой статье представлена ​​унифицированная методологическая основа для одновременной обработки одного первичного человеческого VS или образца GAN для нескольких последующих приложений: клеточная специфическая культура, экстракция белка, сохранение РНК, сбор опухолевых секретов и фиксация тканей. В этой работе также подробно описывается хирургический сбор и обработка спинномозговой жидкости человека (CSF) и перилимф во время трансабиринтной VS-резекции, поскольку эти тесно связанные ткани могут служить важными источниками биомаркеров для VS. Наконец, этот протокол представляет собой шаги для вирусной трансдукции первичных человеческих VS-клеток в культуре в качестве нового применения этой ткани для использования в генной терапии.

Protocol

Письменное информированное согласие на сбор всех образцов было получено до операции, и эксперименты проводились в соответствии с Кодексом этики Всемирной медицинской ассоциации (Хельсинская декларация). Все разделы протокола исследования были одобрены Управлением по надзору за исс?…

Representative Results

Первичные человеческие ВС-клетки в культуре, как установлено в разделе 5, можно рассматривать как информативные модели связанных с болезнями процессов во многих последующих исследовательских приложениях ( рисунок 1 ). Здоровые клетки Шванна, культивир…

Discussion

В этой рукописи описывается унифицированная методологическая основа исследования VS, в которой описывается одновременная обработка образцов VS и GAN человека для последующих исследований. Поскольку исследование VS входит в эпоху прецизионной медицины, подготовка одного и того же образц…

Materials

BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip	Corning	354087	Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)
CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile	Greiner Bio-One	188161
CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile	Greiner Bio-One	227261
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm	Greiner Bio-One	628160
Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered	Sigma-Aldrich	C1639
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile	Corning	3526
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml	Thermo Fisher Scientific	10313-039
DMEM/F-12, 500 ml	Thermo Fisher Scientific	11320-033
Dumont #3 Forceps, Dumoxel	Fine Science Tools	11231-30	Autoclave prior to use
Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox	Fine Science Tools	11251-20	Autoclave prior to use
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml	Thermo Fisher Scientific	10437-028	Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer
Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder	Sigma-Aldrich	H3506
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile	EMD Millipore	SLGP033RS
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline	Sigma-Aldrich	P6148	Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 ml	Thermo Fisher Scientific	10010-023	Autoclave prior to use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml	Thermo Fisher Scientific	15140-122
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets	Roche	04906845001
Pierce Protease Inhibitor Tablets	Thermo Fisher Scientific	88666
Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml	Variable	Variable
Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes	E&K Scientific	EK-10539
PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in	BD	301629
RIPA Buffer	Boston BioProducts	BP-115
RNAlater (RNA stabilization solution)	Thermo Fisher Scientific	AM7021
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml	Eppendorf	022363719	Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml	Eppendorf	022363204	Autoclave prior to use
Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml	Hospira	0409-1966-05
Scalpel Blades – #15	Fine Science Tools	10015-00
Schuknecht Suction Tube 24 gauge	Bausch + Lomb	N1698 42	Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker
Specimen Container, OR sterile, 4OZ	Medline	DYND30331H
Stemi 2000-C Stereo Microscope	Zeiss	000000-1106-133
Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in.	BD	309630
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml	BD	309659
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml	BD	309656
Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe	Cole-Parmer	CP25013