إطار منهجي موحد لبحوث شفاني الدهليزي
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو الخطوط العريضة لجمع ومعالجة العينات الجراحية البشرية لتطبيقات المصب متعددة في شفاني الدهليزي والبحوث خلية شوان.
Abstract
ششوانوماس الدهليزي هي الأورام الأكثر شيوعا من زاوية سيريبيلوبونتين، مما يشكل 6-8٪ في المئة من جميع النمو داخل الجمجمة. على الرغم من أن هذه الأورام تسبب فقدان السمع العصبي في ما يصل إلى 95٪ من الأفراد المتضررين، والآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا فقدان السمع تبقى بعيد المنال. توضح هذه المقالة الخطوات المنصوص عليها في مختبرنا لتسهيل جمع ومعالجة مختلف عينات الأنسجة البشرية الأولية لتطبيقات البحوث المصب لا يتجزأ من دراسة ششوانوماس الدهليزي. على وجه التحديد، يصف هذا العمل إطار منهجي موحد لجمع ومعالجة وثقافة شوان وخلايا شفاني من العينات الجراحية. يتم دمج هذا مع خطوات المعالجة المتوازية التي تعتبر ضرورية حاليا للبحوث الحالية: جمع الورم وإفرازات الأعصاب، والحفاظ على الحمض النووي الريبي واستخراج البروتين من الأنسجة التي تم جمعها، تثبيت الأنسجة لإعداد أقسام،د تعرض الخلايا البشرية الأولية إلى الفيروسات المرتبطة الغدة لتطبيق العلاج الجيني. بالإضافة إلى ذلك، هذا العمل يسلط الضوء على النهج الجراحي ترانزبيرينثين لجمع هذا الورم كفرصة فريدة للحصول على ظهارة حسية الإنسان من الأذن الداخلية و بيرليمف. وتقدم نصائح لتحسين الجودة التجريبية والمزالق المشتركة أبرزت.
Introduction
ششوانوماس الدهليزي (فس) هي الأورام الأكثر شيوعا من زاوية سيريبيلوبونتين، وتشخص في 1 من كل 100،000 شخص. على الرغم من غير النقيلي، وهذه الأورام تؤثر بشدة على نوعية حياة المريض 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . الأفراد المصابون عادة يعانون من فقدان السمع، وطنين، والشعور بالامتلاء السمعي. الأعراض تصبح المنهكة على نحو متزايد مع نمو الورم، مما تسبب في مشاكل التوازن، وشلل في الوجه، وضعف وظائف العصب القحفي الأخرى. المضاعفات التي تهدد الحياة بسبب ضغط الدماغ قد تتسبب أيضا 7 .
تقتصر خيارات الإدارة ل فس أساسا على الانتظار الساهرة للأورام الثابتة والعلاج الإشعاعي المجسم أو استئصال الجراحي لزراعة الأورام <sأوب كلاس = "كريف"> 8. إن الاستئصال الجراحي لهذه الأورام في المستشفيات التابعة للبحوث يتيح الفرصة لاكتساب وتحليل أنسجة الورم الطازجة التي يتم جمعها خلال عمليات الجراحة. واحد نهج جراحية محددة ل فس، استئصال ترانزبايرينثين، يمكن أن توفر حتى الوصول إلى ظهارة حسية الإنسان قيمة من الأذن الداخلية و بيرليمف.
لأن فس تنشأ من العصب الحسي المحيطي ( أي العصب الدهليزي)، فمن المهم مقارنة الملاحظات المرتبطة فس مع تلك المستمدة من العصب السيطرة المناسبة، مثل العصب الأذني عظيم الإنسان (غان). يتم التضحية غانز صحي بانتظام خلال استئصال الأوتار أو تشريح الرقبة، ويمكن استخدامها كنماذج قوية لصحة شوان علم وظائف الأعضاء الخلية 9 .
لأنه لا توجد أدوية وافقت عليها ادارة الاغذية والعقاقير لعلاج أو الوقاية من متفرقة فس، فمن الضروري أن الباحثين توضيح ميكا الجزيئية الكامنةنيسز من هذا المرض لتحديد الأهداف العلاجية. البروتينات التي تبين أن تلعب دورا في المرضية فس تشمل ميرلين، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (فيغف)، الأكسدة الحلقية 2 (كوكس-2)، عامل النووي كابا B (نف-κB)، عامل نخر الورم ألفا (تنف-ألفا) ، ومستقبل عامل نمو البشرة (إغفر)، وجزيئات التشوير ذات الصلة 10 و 11 و 12 و 13 و 14 و 15 و 16 و 17 .
وقد توسعت التطورات الأخيرة وتحسين بروتوكولات لجمع ومعالجة، والثقافة، والتحقيق المصب من ششوانوماس الدهليزي الإنسان الأولية وأنسجة العصب صحية 18 ، 19 . ومع ذلك، تم تصميم معظم البروتوكولات القائمة لاستيعاب إعدادمن هذه الأنسجة لتطبيق بحث واحد المصب ( أي ثقافة الخلية وحدها). تقدم هذه المقالة إطار منهجي موحد للتجهيز في وقت واحد من فس واحد أو عينة غان الإنسان الأساسية لتطبيقات المصب متعددة: ثقافة نوع الخلية محددة، واستخراج البروتين، والحفاظ على الحمض النووي الريبي، وجمع إفراز الورم، وتثبيت الأنسجة. هذا العمل أيضا تفاصيل جمع الجراحية ومعالجة السائل النخاعي البشري (كسف) و بيرليمف خلال ترانزابيرابينثين فس استئصال، لأن هذه الأنسجة وثيقة الصلة قد تكون بمثابة مصادر هامة من المؤشرات الحيوية ل VS. وأخيرا، يعرض هذا البروتوكول خطوات لتنبيغ الفيروسية من الخلايا فس الإنسان الأولية في الثقافة باعتبارها تطبيق رواية من هذا النسيج لاستخدامها في العلاج الجيني.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه المخطوطة إطارا منهجيا موحدا للبحث فس، وتحدد المعالجة المتزامنة للعينات البشرية فس و غان لتطبيقات البحث المصب. كما يدخل بحث فس عمر الطب الدقة، وإعداد نفس العينة في أشكال قادرة على الإجابة على العديد من الأسئلة البحثية سوف تمكن من اكتشاف رؤى الجزيئية والخلوية …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصمم وغيرها من منح اضطرابات الاتصالات R01DC015824 (كمز) و T32DC00038 (دعم جيس و سد)، ومنح وزارة الدفاع W81XWH-14-1-0091 (كمز)، ومؤسسة بيرتاريللي (كمز) ، ومؤسسة يوم نانسي سايلز (كمز)، ومركز لور تينيتوس للبحوث (كمز)، ومؤسسة بارنز (كمز).
Materials
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
Riferimenti
- Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
- Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
- Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas. Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).
- Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. True incidence of vestibular schwannoma?. Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).
- Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma?. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
- Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
- Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
- Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. Management of sporadic vestibular schwannoma. Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).
- Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
- Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
- Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
- Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
- Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
- Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
- Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
- Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
- Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
- Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
- Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
- Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
- Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
- Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
- Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
- Archibald, D. J., et al. B7-H1 expression in vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215 (2016).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
- Lysaght, A. C., et al. Proteome of human perilymph. J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).
- Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
- Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
- Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868 (2013).
