מסגרת מתודולוגית מאוחדת למחקר שוואנומה שיווי המשקל
Summary
המטרה של פרוטוקול זה הוא מתאר את אוסף ועיבוד של דגימות כירורגיות אנושיות עבור יישומים במורד הזרם רבים schwannoma שיווי המשקל מחקר שוואן התא.
Abstract
Schwannomas שיווי המשקל הם neoplasms הנפוצים ביותר של זווית cerebellopontine, מה שהופך את 6-8% אחוז של כל גדיולים תוך גולגולתיים. למרות שגידולים אלה גורמים לאובדן שמיעה חושי עד ל -95% מהנפגעים, המנגנונים המולקולריים שבבסיס אובדן השמיעה נותרים חמקמקים. מאמר זה מתאר את הצעדים שנקבעו במעבדה שלנו כדי להקל על איסוף ועיבוד של דגימות רקמות אדם שונות עבור יישומים במורד הזרם מחקר אינטגרלי ללימוד שוואנומות שיווי המשקל. באופן ספציפי, עבודה זו מתארת מסגרת מתודולוגית אחידה לאיסוף, לעיבוד ולתרבות של שוואן ותאי שוואנומה מדגימות כירורגיות. זה משולב עם צעדים עיבוד מקבילים שנחשבים כיום חיוניים למחקר הנוכחי: אוסף של גידול הפרשות העצבים, שימור של רנ"א והפקת חלבון מ רקמות שנאספו, קיבוע של הרקמה להכנת סעיפים,ד את החשיפה של תאים אנושיים ראשוניים כדי adeno הקשורים וירוסים ליישום על טיפול גנטי. בנוסף לכך, עבודה זו מדגישה את הגישה התיראבינארית-כירורגית לאיסוף גידול זה כהזדמנות ייחודית להשגת אפיתל חושי אנושי מהאוזן הפנימית ומהפרילימף. טיפים לשיפור האיכות הניסיונית מסופקים ומלכודות נפוצות מודגשות.
Introduction
שוונומות שיווי המשקל (VS) הן הנפוצים ביותר של זווית cerebellopontine, מאובחנים 1 בכל 100,000 אנשים. אם כי לא גרורות, גידולים אלה משפיעים קשות על איכות החיים של המטופל 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . אנשים נפגעים בדרך כלל לחיות עם אובדן שמיעה, טינטון, ותחושה של מלאות aural. התסמינים הופכים יותר ויותר מתישים ככל הגידול גדל, גרימת בעיות איזון, שיתוק בפנים, ואת הליקוי של תפקודים עצביים גולגולתיים אחרים. סיבוכים מסכני חיים עקב דחיסת גזע המוח עשויים גם להתרחש 7 .
אפשרויות ניהול עבור VS מוגבלים בעיקר ממתין מחכה לגידולים סטטיים ו הקרנות סטריאוטקטיות או כריתה כירורגית לגידול גידולים <sUp class = "xref"> 8. הסרה כירורגית של גידולים אלה בבתי חולים המזוהים עם מחקר מציעה הזדמנות לרכוש ולנתח רקמות סרטניות חדשות שנאספו במהלך ניתוחים לחולים. גישה כירורגית ספציפית ל VS, הניתוח של translabyrinthine, יכולה אף להציע גישה לאפיתל סנסורי אנושי חשוב מהאוזן הפנימית ומהפרילימף.
מכיוון ש – VSs נובעים מעצב חושי היקפי ( כלומר, עצב שיווי המשקל), חשוב להשוות בין תצפיות הקשורות ל – VS לבין אלו הנובעות מעצב בקרה מתאים, כגון עצב האאוריקולרי האנושי (GAN). גנים בריאים הם מקריבים באופן קבוע במהלך parotidectomies או חתכים הצוואר והוא יכול לשמש מודלים חזקים לבריאות פיזיולוגית התא Schwann 9 .
מאחר שאין תרופות המאושרות על ידי ה- FDA לטיפול או למניעת VS סדיר, חיוני שחוקרים יבהירו את המולה המולקולרית הבסיסיתNisms של המחלה כדי לזהות מטרות טיפוליות. חלבונים אשר הוכיחו כי הם ממלאים תפקיד בפתוגנזה של VS כוללים את המארלין, גורם הגדילה האנדותל של כלי הדם (VEGF), cyclooxygenase 2 (COX-2), גורם גרעיני kappa B (NF-κB), גורם נמק בגידול אלפא (TNF-alpha) , קולטן גורם גדילה של אפידרמיס (EGFR), ומולקולות איתות קשורות 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
ההתקדמות האחרונות הרחיבו ושיפרו פרוטוקולים לאיסוף, עיבוד, תרבות, ומחקר במורד הזרם של schwannomas וסטיבולרי ראשוני האדם ורקמות עצב בריא 18 , 19 . עם זאת, רוב הפרוטוקולים הקיימים נועדו להתאים את הכנהAtion של רקמות כאלה עבור יישום מחקר במורד אחד ( כלומר, תרבות התא לבד). מאמר זה מציג מסגרת מתודולוגית מאוחדת לעיבוד סימולטני של מדגם VS ראשוני יחיד או מדגם GAN ליישומים רבים במורד הזרם: סוג תא ספציפי תרבות, מיצוי חלבונים, שימור רנ"א, אוסף הפרשת הגידול וקיבוע רקמות. עבודה זו גם מפרטת את האוסף הכירורגי ואת העיבוד של נוזל המוח השדרה האנושי (CSF) ו perlymph במהלך כריתת VSS translanabyrinthine, כמו אלה רקמות הקשורות קשר הדוק עשוי לשמש מקורות חשובים של סמנים ביולוגיים עבור VS. לבסוף, פרוטוקול זה מציג שלבים התמרה ויראלי של תאים VS האדם העיקרי בתרבות כמו יישום חדשני של רקמה זו לשימוש בטיפול גנטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה מתאר מסגרת מתודולוגית אחידה למחקר VS, המתאר את העיבוד בו-זמני של דגימות VS ו- GAN אנושיים עבור יישומי מחקר במורד הזרם. כאשר מחקר VS נכנס לרפואה מדויקת, הכנת המדגם אותו בצורות המסוגלות לענות על שאלות מחקר רבות תאפשר גילוי של תובנות מולקולריות, תאיות, גנטיות ופרוטומ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של חירשות הפרעות תקשורת אחרות מעניקה R01DC015824 (KMS) ו T32DC00038 (תמיכה JES ו SD), משרד הביטחון מענק W81XWH-14-1-0091 (KMS), קרן ברטרלי (KMS) , Nancy Sayles Day Foundation (KMS), מרכז המחקר לאואר טיניטוס (KMS) וקרן בארנס (KMS).
Materials
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
Riferimenti
- Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
- Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
- Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas. Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).
- Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. True incidence of vestibular schwannoma?. Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).
- Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma?. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
- Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
- Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
- Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. Management of sporadic vestibular schwannoma. Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).
- Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
- Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
- Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
- Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
- Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
- Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
- Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
- Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
- Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
- Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
- Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
- Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
- Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
- Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
- Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
- Archibald, D. J., et al. B7-H1 expression in vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215 (2016).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
- Lysaght, A. C., et al. Proteome of human perilymph. J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).
- Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
- Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
- Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868 (2013).
