Et enhetlig metodologisk rammeverk for Vestibular Schwannoma Research

Summary

Målet med denne protokollen er å skissere samlingen og behandlingen av menneskelige kirurgiske prøver for flere nedstrømsapplikasjoner i vestibulær schwannom og Schwann-cellforskning.

Abstract

Vestibulære schwannomer er de vanligste neoplasmaene i cerebellopontinvinkelen, og utgjør 6-8% av alle intrakranielle vekst. Selv om disse svulstene forårsaker sensorineuralt hørselstap i opptil 95% av de berørte individer, forblir de molekylære mekanismene som ligger til grunn for dette hørselstapet unnvikende. Denne artikkelen skisserer trinnene etablert i vårt laboratorium for å lette oppsamlingen og behandlingen av forskjellige primære humane vevsprøver for nedstrøms forskningsapplikasjoner integrert i studiet av vestibulære schwannomer. Spesielt beskriver dette arbeidet et enhetlig metodologisk rammeverk for innsamling, behandling og kultur av Schwann- og schwannomaceller fra kirurgiske prøver. Dette er integrert med parallelle behandlingsstrinn som nå anses som essensielt for dagens forskning: innsamling av svulst- og nervesekresjoner, bevaring av RNA og ekstraksjon av protein fra oppsamlede vev, fiksering av vev for fremstilling av seksjoner, enD eksponering av primære humane celler til adeno-assosierte virus for anvendelse på genterapi. I tillegg fremhever dette arbeidet den translabyrintiske kirurgiske tilnærmingen for å samle denne svulsten som en unik mulighet til å skaffe menneskelig sensorisk epitel fra indre øre og perilimf. Tips for å forbedre eksperimentell kvalitet er gitt og vanlige fallgruver uthevet.

Introduction

Vestibulære schwannomer (VS) er de vanligste neoplasmaene i cerebellopontinvinkelen, diagnostisert hos 1 av hver 100.000 individer. Selv om ikke-metastatisk, påvirker disse svulstene alvorlig pasientens livskvalitet ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Berørte personer lever vanligvis med hørselstap, tinnitus og en følelse av lydstyrke. Symptomene blir stadig svekkende som tumoren vokser, forårsaker balanseproblemer, ansiktslammelse og svekkelse av andre kraniale nervefunksjoner. Livstruende komplikasjoner på grunn av hjernestamkompresjon kan også følge ⁷ .

Administrasjonsmuligheter for VS er i hovedsak begrenset til vaktfull venter på statiske svulster og stereotaktisk strålebehandling eller kirurgisk reseksjon for voksende svulster <sOpp klasse = "xref"> 8. Den kirurgiske fjerning av disse svulstene i forskningsrelaterte sykehus gir mulighet til å erverve og analysere friskt tumorvæv samlet under pasientoperasjoner. En spesifikk kirurgisk tilnærming til VS, den translabyrintiske reseksjonen, kan til og med gi tilgang til verdifull menneskelig sensorisk epitel fra indre øre og perilimf.

Fordi VS oppstår fra en perifer sensorisk nerve ( dvs. vestibulærnerven), er det viktig å sammenligne VS-assosierte observasjoner med de som er avledet fra en passende kontrollnerve, slik som den menneskelige store auricularnerven (GAN). Sunn GAN blir regelmessig ofret under parotidektomi eller nakke-disseksjoner og kan brukes som robuste modeller for sunn Schwann-cellefysiologi ⁹ .

Fordi det ikke finnes FDA-godkjente stoffer for behandling eller forebygging av sporadisk VS, er det avgjørende at forskere belyser den underliggende molekylære mechaNismer av sykdommen for å identifisere terapeutiske mål. Proteiner som har vist seg å spille en rolle i VS-patogenesen inkluderer merlin, vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF), cyklooksygenase 2 (COX-2), nukleær faktor kappa B (NF-KB), tumornekrosefaktor alfa (TNF-alfa) , Epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) og tilhørende signalmolekyler ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} .

Nylige fremskritt har utvidet og forbedret protokoller for innsamling, behandling, kultur og nedstrøms undersøkelse av primære humane vestibulære schwannomer og friske nervevev ^{18 , 19} . Imidlertid er de fleste eksisterende protokoller designet for å imøtekomme preparatetAtion av slike vev for en enkelt nedstrøms forskningsapplikasjon ( dvs. cellekultur alene). Denne artikkelen presenterer et enhetlig metodologisk rammeverk for samtidig behandling av en enkelt primær menneskelig VS- eller GAN-prøve for flere nedstrømsapplikasjoner: celletypespesifikk kultur, proteinutvinning, RNA-bevaring, svulstsekresjonsoppsamling og vevfiksering. Dette arbeidet beskriver også kirurgisk innsamling og behandling av human cerebrospinalvæske (CSF) og perilimf under translabyrint VS-reseksjon, da disse nært besluttede vevene kan tjene som viktige kilder til biomarkører for VS. Endelig presenterer denne protokollen trinn for viral transduksjon av primære humane VS-celler i kultur som en ny anvendelse av dette vevet for bruk i genterapi.

Protocol

Skriftlig informert samtykke til innsamling av alle prøver ble oppnådd før operasjonen, og forsøkene ble utført i henhold til etikkloven fra Verdens medisinske forening (Helsinki-erklæringen). Alle deler av studieprotokollen ble godkjent av den institusjonelle gjennomgangskomiteen i Massachusetts Eye and Ear og Massachusetts General Hospital. MERK: Seksjonene 1-7 nedenfor er konstruert for å bli utført i rekkefølge ved mottak av en primær human VS eller GAN-prøve fra operasjonen. …

Representative Results

Primære humane VS-celler i kultur, som etablert i avsnitt 5, kan behandles som informative modeller for sykdomsassosierte prosesser i mange nedstrøms forskningsapplikasjoner ( Figur 1 ). Sunn Schwann-celler dyrket i seksjon 6 gir et direkte og lærerikt sammenligningspunkt. Som beskrevet nedenfor, er omfattende data fra VS og GANer behandlet i henhold til dette enhetlige metodiske ramme tilgjengelig i flere artikler tidligere publisert 12…

Discussion

Dette manuskriptet beskriver et enhetlig metodologisk rammeverk for VS-forskning, som beskriver samtidig behandling av menneskelige VS- og GAN-prøver for nedstrøms forskningsapplikasjoner. Som VS-forskning går inn i en alder av presisjonsmedisin, vil det bli mulig å oppdage molekylær, cellulær, genetisk og proteomisk innsikt som er spesifikke for individuelle pasienter, og forberede den samme prøven i skjemaer som kan svare på en rekke forskningsspørsmål.

Renheten av humane Schwann…

Materials

BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip	Corning	354087	Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)
CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile	Greiner Bio-One	188161
CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile	Greiner Bio-One	227261
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm	Greiner Bio-One	628160
Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered	Sigma-Aldrich	C1639
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile	Corning	3526
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml	Thermo Fisher Scientific	10313-039
DMEM/F-12, 500 ml	Thermo Fisher Scientific	11320-033
Dumont #3 Forceps, Dumoxel	Fine Science Tools	11231-30	Autoclave prior to use
Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox	Fine Science Tools	11251-20	Autoclave prior to use
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml	Thermo Fisher Scientific	10437-028	Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer
Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder	Sigma-Aldrich	H3506
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile	EMD Millipore	SLGP033RS
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline	Sigma-Aldrich	P6148	Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 ml	Thermo Fisher Scientific	10010-023	Autoclave prior to use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml	Thermo Fisher Scientific	15140-122
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets	Roche	04906845001
Pierce Protease Inhibitor Tablets	Thermo Fisher Scientific	88666
Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml	Variable	Variable
Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes	E&K Scientific	EK-10539
PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in	BD	301629
RIPA Buffer	Boston BioProducts	BP-115
RNAlater (RNA stabilization solution)	Thermo Fisher Scientific	AM7021
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml	Eppendorf	022363719	Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml	Eppendorf	022363204	Autoclave prior to use
Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml	Hospira	0409-1966-05
Scalpel Blades – #15	Fine Science Tools	10015-00
Schuknecht Suction Tube 24 gauge	Bausch + Lomb	N1698 42	Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker
Specimen Container, OR sterile, 4OZ	Medline	DYND30331H
Stemi 2000-C Stereo Microscope	Zeiss	000000-1106-133
Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in.	BD	309630
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml	BD	309659
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml	BD	309656
Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe	Cole-Parmer	CP25013