Vestibular Schwannoma 연구를위한 통합 방법론 체계
Summary
이 프로토콜의 목표는 vestibular schwannoma 및 Schwann 세포 연구에서 여러 하류 응용 프로그램에 대한 인간의 수술 샘플 수집 및 처리를 설명하는 것입니다.
Abstract
전정 신경초종은 cerebellopontine 각의 가장 흔한 신 생물이며 모든 두개 내 성장의 6-8 %를 차지합니다. 이 종양은 영향받은 개체의 최대 95 %에서 감각 신경성 청력 손실을 일으키지 만,이 청력 손실의 근간을 이루는 분자 메커니즘은 아직 파악하기 어렵습니다. 이 기사는 전정 신경초종 연구에 필수적인 다운 스트림 연구 응용을위한 다양한 1 차 인간 조직 샘플의 수집과 처리를 용이하게하기 위해 연구실에서 수립 된 단계를 설명합니다. 특히,이 연구는 외과 표본에서 Schwann과 schwannoma 세포의 수집, 가공 및 배양에 대한 통일 된 방법 론적 틀을 설명합니다. 이것은 종양과 신경 분비물의 수집, RNA의 보존과 수집 된 조직에서의 단백질 추출, 절편 준비를위한 조직 고정, 현재의 연구에 필수적인 것으로 간주되는 병행 처리 단계와 통합되어 있습니다.유전자 치료에 응용하기 위해 아데노 관련 바이러스에 일차 인간 세포를 노출시키는 것. 또한,이 연구는이 종양을 내이 및 외음부에서 인간의 감각 상피를 얻을 수있는 독특한 기회로 수집하는 외과 적 접근법을 강조합니다. 실험적인 품질을 향상시키기위한 팁이 제공되고 일반적인 함정이 강조 표시됩니다.
Introduction
Vestibular schwannomas (VSs)는 10 만명당 1 명꼴로 진단되는 소뇌 뼈의 각도에서 가장 흔한 신 생물입니다. 비 전이성이더라도이 종양은 환자의 삶의 질 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6에 심각한 영향을 미칩니다. 영향을받는 개인은 일반적으로 난청, 이명 및 청각 충만감을 느낍니다. 종양이 성장함에 따라 증상이 점점 쇠약하게되어 균형 문제, 안면 마비 및 다른 뇌 기능의 손상을 초래합니다. 뇌간 압박으로 인한 생명을 위협하는 합병증 또한 발생할 수 있습니다.
대장 증후군의 관리 옵션은 근본적으로 정적 종양 및 확립 된 방사선 요법 또는 성장하는 종양의 외과 적 절제를 기다리는 것에주의해야합니다 <sup class = "xref"> 8. 연구 제휴 병원에서이 종양을 외과 적으로 제거하면 환자 수술 중에 수집 된 신선한 종양 조직을 수집하고 분석 할 수있는 기회가 제공됩니다. 관상 동맥 우회술 (translabyrinthine resection) 인 VS에 대한 한 가지 구체적인 외과 적 접근법은 귀와 외음부에서 귀중한 인간 감각 상피에 접근 할 수 있습니다.
VS는 말초 감각 신경 ( 즉, 전정 신경)에서 발생하기 때문에 VS 관련 관찰을 인간의 위장 신경 (GAN)과 같은 적절한 제어 신경에서 유도 된 것과 비교하는 것이 중요합니다. 건강한 GAN은 뇌하수체 제거 또는 목구멍 파열시 정기적으로 희생되며 건강한 Schwann 세포 생리학을위한 견고한 모델로 사용될 수 있습니다.
Sporadic VS의 치료 나 예방을위한 FDA 승인 의약품이 없기 때문에 연구원들이 근본적인 분자 메커니즘을 명료하게 밝혀야합니다치료 목표를 밝힐 질병의 진전. 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 시클로 옥 시게나 제 2 (COX-2), 핵 인자 카파 B (NF-κB), 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) , 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 및 관련 신호 분자 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17을 포함한다 .
최근의 진보는 일차 인간 전정 신경초와 건강한 신경 조직의 수집, 처리, 배양 및 하류 조사를위한 프로토콜을 확장하고 개선했습니다 18 , 19 . 그러나, 대부분의 기존의 프로토콜은 준비를 수용하도록 설계되었습니다단일 하류 연구 응용 ( 즉, 세포 배양 만)에 대한 그러한 조직의 배양. 이 기사는 세포 유형 특이 적 배양, 단백질 추출, RNA 보존, 종양 분비 수집 및 조직 고정과 같은 다중 다운 스트림 응용 분야에 대한 단일 기본 인간 VS 또는 GAN 시료의 동시 처리를위한 통일 된 방법 론적 틀을 제시합니다. 이 작품은 translabyrinthine VS 절제술 동안 인간 뇌척수액 (CSF)과 외음근의 외과 수집 및 가공에 대해 자세히 설명합니다.이 밀접한 관련 조직은 VS에 대한 중요한 바이오 마커의 역할을 할 수 있습니다. 마지막으로,이 프로토콜은 유전자 치료에 사용하기 위해이 조직의 새로운 응용 프로그램으로 문화에서 기본 인간 VS 세포의 바이러스 성 전달을위한 단계를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고는 VS 연구를위한 통일 된 방법 론적 틀을 설명하며, 하류 연구 응용을위한 인간 VS와 GAN 표본의 동시 처리를 개괄합니다. VS 연구가 정밀 의학의 시대에 접어 들면서 수많은 연구 질문에 답할 수있는 형태로 동일한 샘플을 준비하면 개별 환자에게 특유한 분자, 세포, 유전 및 proteomic 통찰력을 발견 할 수 있습니다.
인간 Schwann 세포와 VS 배양의 순도는 S100 마커에 양?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국방부 보조금 W81XWH-14-1-0091 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS), 국방부 보조금 R01DC015824 (KMS) 및 T32DC00038 (JES 및 SD 지원) , Nancy Sayles Day Foundation (KMS), Lauer Tinnitus Research Center (KMS) 및 Barnes Foundation (KMS)이 포함됩니다.
Materials
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
Riferimenti
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