体外F-肌动蛋白在早期体的聚合
Summary
早期 endosome 功能依赖于 F-肌动蛋白聚合。在这里, 我们描述了一个 microscopy-based 的体外测定, 每天的核化和聚合的 f-肌动蛋白在早期内涵膜的试管, 从而呈现这一系列复杂的反应, 可生化和遗传操作.
Abstract
许多早期的 endosome 功能, 特别是货物蛋白分选和膜变形, 依赖于内涵膜上有核的短的 f-肌动蛋白纤维的补丁。我们已经建立了一个 microscopy-based 的体外检测, 每天的核化和聚合的 f-肌动蛋白在早期内涵膜的试管, 从而呈现这一系列复杂的反应, 可遗传和生物化学操作.从表达早期内涵蛋白 GFP-RAB5 的细胞中浮选蔗糖梯度制备内涵分数。胞浆组分是由分离的细胞分批制备的。如果需要的话, 内涵和胞浆组分都可以在液氮中冷冻保存。在试验中, 内涵和胞浆组分混合, 在适当的条件下 (例如,离子强度, 还原环境) 在37° c 下孵育混合物。在所需的时间, 反应混合物是固定的, 和 f-肌动蛋白是揭示与笔。然后用荧光显微镜对肌动蛋白成核和聚合进行分析。在这里, 我们报告, 这种方法可以用来研究的作用, 涉及的因素, 在膜上的肌动蛋白成核, 或在随后的伸长, 分支, 或交联的 f-肌动蛋白丝。
Introduction
在更高的真核细胞中, 蛋白质和脂质被内化为早期的体, 在那里进行分类。一些蛋白质和脂质, 这是注定要利用, 被纳入到管状区域的早期体, 然后运到等离子膜或转移到高尔基体网络 (TGN)1,2。相比之下, 其他的蛋白质和脂质被选择性地包装到早期体的区域, multivesicular 出现。这些地区扩展, 并在脱离早期内涵膜, 最终成熟成自由内涵载体囊泡或 multivesicular 体 (ECV/MVBs), 负责货物运输对晚体1, 2。
肌动蛋白在与内涵分选能力和 endosome 生物相关的膜重塑过程中起着至关重要的作用。蛋白质的分类沿着回收途径的等离子膜或 TGN 取决于 retromer 复合物和相关的蛋白质。这种分拣机械似乎是耦合到回收小管通过相互作用的 retromer 复合体, 与黄蜂和疤痕同系物 (洗涤) 复杂和分支肌动蛋白3,4,5.相反, 注定要降解的分子, 特别是活化的信号受体, 被分类成腔内囊泡 (ILVs) 的内涵分拣复合物所需的运输 (ESCRT)2,6, 7。尽管肌动蛋白在 ESCRT 依赖性分选过程中可能扮演的角色尚不清楚, 但 F-肌动蛋白在 ECV/MVBs 的生物和早期体的运输中起着重要作用。特别是, 我们发现蛋白 A2 结合胆固醇丰富地区早期 endosome, 并与 spire1, 核 F-肌动蛋白聚合。在体上观察到的分支肌动蛋白网络的形成, 需要蛋白 (ARP) 2/3 复合体的分支活性, 以及蛋白质 moesin 和肌动蛋白结合蛋白 cortactin8,9。
在这里, 我们描述了一个 microscopy-based 的体外测定, 每天的核化和聚合的 f-肌动蛋白在早期内涵膜的试管。该方法已被用于研究蛋白 A2 在 f-肌动蛋白成核和 moesin 和 cortactin 形成内涵肌动蛋白网络中的作用8,9。通过这种体外协议, 在肌动蛋白聚合过程中体发生的一系列复杂反应, 可以对过程的顺序步骤进行生物化学和分子分析, 包括肌动蛋白成核、线性聚合、分枝和交联。
Protocol
Representative Results
Discussion
肌动蛋白在 endosome 膜动力学中起关键作用4,14。我们以前报道, 肌动蛋白成核和聚合发生在早期体, 形成小的 f-肌动蛋白补丁或网络。这些 f-肌动蛋白网络是绝对需要的膜运输超越早期体沿降解途径。干扰此成核和聚合过程的任何步骤, 防止 endosome 成熟, 从而对后期的体 andlysosomes9,11,15…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
得到瑞士国家科学基金会的支持;瑞士 Sinergia 计划;波兰-瑞士研究方案 (PSPB-094/2010);化学生物学中的 NCCR;LipidX 来自瑞士 SystemsX.ch 倡议, 由瑞士国家科学基金会 (j.g) 评估。o.m. 得到了 EMBO 长期研究金 (ALTF-516-2012) 的支持。
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22um | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-ml polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18X18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μl yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1000-μl Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-ml test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
Riferimenti
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
- Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up!. Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).
- Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
- Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
- Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
- Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
- Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
- Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
- Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
- Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).
- Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).
