In Vitro Polymérisation de l’actine F sur Endosomes précoces
Summary
Début endosome fonctions dépendent de la polymérisation de l’actine-F. Nous décrivons ici une analyse axée sur la microscopie in vitro qui reconstitue la nucléation et la polymérisation de l’actine F sur les membranes endosomale précoce dans des éprouvettes, rendant ainsi cette série complexe de réactions se prêtent à biochimiques et génétiques manipulations.
Abstract
Beaucoup de fonctions endosome précoce, particulièrement fret protéine membranaire de tri et de déformation, dépendent des patchs de courts filaments d’actine F nucléées sur la membrane endosomale. Nous avons établi une analyse axée sur la microscopie in vitro qui reconstitue la nucléation et la polymérisation de l’actine F sur les membranes endosomale précoce dans des éprouvettes, rendant ainsi cette série complexe de réactions se prêtent à la génétique et biochimique manipulations. Endosomale fractions sont préparées par flottaison dans les gradients de sucrose de cellules exprimant la protéine d’endosomes précoces GFP-RAB5. Fractions cytosoliques sont préparées à partir des lots distincts de cellules. Les endosomes et les fractions cytosoliques peuvent être stockées congelés dans l’azote liquide, si nécessaire. Dans l’essai, les endosomes et les fractions cytosoliques sont mélangées, et le mélange est incubé à 37 ° C dans des conditions appropriées (par exemple, force ionique, réduisant l’environnement). À l’heure souhaitée, le mélange réactionnel est fixe, et l’actine-F se révèle avec la phalloïdine. Polymérisation et nucléation de l’actine sont ensuite analysés par microscopie à fluorescence. Nous rapportons ici que ce test peut être utilisé pour étudier le rôle des facteurs qui jouent un rôle dans la nucléation de l’actine sur la membrane ou l’allongement subséquent, ramification ou réticulation des filaments d’actine-F.
Introduction
Dans les cellules eucaryotes supérieurs, les protéines et les lipides sont internalisés dans les endosomes précoces où tri se produit. Certaines protéines et les lipides, qui sont destinés à être réutilisés, sont incorporés dans des régions tubulaires des endosomes précoces et ensuite transportées vers la membrane plasmique ou pour le trans-Golgi network (TGN)1,2. En revanche, les autres protéines et des lipides sont emballés sélectivement en régions des endosomes précoces qui présentent un aspect multivésiculaires. Développer ces régions et, sur le détachement des membranes d’endosomes précoces, éventuellement mature gratuit endosomale transporteur vésicules ou multivésiculaires (VME/Mvc), qui sont chargés du transport de marchandises vers la fin des endosomes1, 2.
L’actine joue un rôle crucial dans le processus de remodelage de membrane associé à la capacité de tri endosomal et endosome biogenèse. Protéine triant le long des voies de recyclage à la membrane plasmique ou le TGN dépend de la retromer complexe et les protéines associées. Ce mécanisme de tri semble être couplée à la formation de recyclage tubules par interactions de la retromer complexe, avec la guêpe et cicatrice homologue (WASH) complexe et ramifié actine3,4,5 . En revanche, molécules destinées à la dégradation, particulièrement active les récepteurs de signalisation, sont triés dans des vésicules intraluminal (ILVs) par les endosomes tri complexes requis pour le transport (ESCRT)2,6, 7. Alors qu’on ne connaît pas le rôle éventuel de l’actine dans le processus de tri ESCRT dépendant, F-actine joue un rôle important dans la biogenèse des VME/MVC et transport au-delà des endosomes précoces. En particulier, nous avons constaté qu’annexine A2 lie régions enrichies en cholestérol et avec spire1 de l’endosome précoce, nucléation de polymérisation de l’actine-F. La formation du réseau ramifié actine observée sur les endosomes requiert l’activité de ramification de la protéine liée à l’actine (ARP) 2/3 complexe, ainsi que la moésine de protéine ERM et la liaison de l’actine protéine cortactin8,9.
Nous décrivons ici une analyse axée sur la microscopie in vitro qui reconstitue la nucléation et la polymérisation de l’actine F sur les membranes endosomes précoces dans des éprouvettes. Ce test a été utilisé précédemment pour enquêter sur le rôle de l’annexine A2 dans la nucléation de l’actine F et de la moésine et cortactin dans la formation d’endosomes actine réseaux8,9. Avec ce protocole in vitro , la série complexe de réactions qui se produisent sur les endosomes au cours de la polymérisation de l’actine se prête à l’analyse biochimique et moléculaire des étapes du processus, y compris de nucléation de l’actine, linéaire polymérisation, ramification et réticulation.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’actine joue un rôle crucial dans l’endosome membrane dynamique4,14. Nous avons déjà indiqué que la polymérisation et nucléation de l’actine se produisent dans les endosomes précoces, formant des petits correctifs d’actine F ou réseaux. Ces réseaux d’actine F est absolument requis pour le transport membranaire au-delà des endosomes précoces le long de la voie de dégradation. Intervenir à n’importe quelle étape de ce processus de nucléa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Prise en charge a été reçue de la Swiss National Science Foundation ; le programme Suisse Sinergia ; le helvético-polonaise recherche Programme (PSPB-094/2010) ; PRN en biologie chimique ; et LipidX de l’initiative Suisse SystemsX.ch, évaluée par la Swiss National Science Foundation (à G.). M. O. a été soutenu par une bourse à long terme de l’EMBO (Fota-516-2012).
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22um | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-ml polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18X18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μl yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1000-μl Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-ml test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
Riferimenti
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
- Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up!. Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).
- Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
- Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
- Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
- Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
- Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
- Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
- Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
- Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).
- Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).
