体外初期エンドソームの F-アクチンの重合
Summary
初期エンドソーム機能 F アクチンの重合によって決まります。ここで、この複雑な一連の反応の生化学的・遺伝的影響を受けやすいレンダリング核生成と、試験管の初期エンドソーム膜に F-アクチンの重合を再構成培養顕微鏡ベースのアッセイを説明します。操作。
Abstract
多機能初期エンドソーム、特に貨物蛋白質を並べ替えると膜変形、エンドソームの膜の上に核形成した短い F アクチンのパッチに依存します。この複雑な一連の反応の遺伝学的および生化学的影響を受けやすいレンダリング核生成と、試験管の初期エンドソーム膜に F-アクチンの重合を再構成培養顕微鏡ベースのアッセイを設けています。操作。エンドソーム分数は初期エンドソーム タンパク質 RAB5 GFP を発現する細胞からのサッカロースの勾配の浮上によって準備されます。細胞質画分は、細胞の別のバッチから用意しています。エンドソームと細胞質画分格納できます液体窒素で凍結に必要な場合。アッセイのエンドソームと細胞質画分を混合、および混合物は、適切な条件 (例えば、イオン強度、環境を削減) の 37 ° C で培養しました。希望の時間に反応混合物を固定すると、および F-アクチン ファロイジンで明らかにされます。アクチン核形成と重合は、蛍光顕微鏡で分析しています。ここで、アクチン核形成膜、またはそれ以降の伸び、分岐、または F アクチン繊維の架橋のどちらかに関与している因子の役割を調査するこのアッセイを使用ことができることを報告します。
Introduction
高等真核生物の細胞のタンパク質や脂質は並べ替えが発生する初期エンドソームを内面化します。いくつかのタンパク質や脂質は、住宅がする運命にあるは初期エンドソームの管状地域に組み込むし、トランスゴルジ ネットワーク (TGN)1、2細胞膜に輸送。対照的に、他のタンパク質や脂質は、多胞性の外観を示す初期エンドソームの領域に選択的にパッケージ化されます。これらの領域を展開し、初期エンドソーム膜から剥離時に無料エンドソーム キャリア小胞または多胞体 (ECV/MVBs) に最終的に成熟したから責任がある後期エンドソーム1,に向かって貨物輸送2。
アクチンは、エンドソーム並べ替え容量とエンドソームの形成と関連付けられる膜改造プロセスで重要な役割を果たしています。タンパク質のリサイクルの経路に沿って、TGN の細胞膜には、レトロマー複合体と関連付けられているタンパク質に依存します。この仕分けの機械リサイクル尿細管を介しての相互作用レトロマー複合体、ハチと傷跡相同 (洗浄) 複雑で分岐したアクチン3,4,5 の形成を結合するようであります。.対照的に、分子分解運命、特にシグナル受容体を活性化、エンドソーム選別輸送 (ESCRT)2,6、複合体によって管腔内小胞 (ILVs) に分類されます。 7。アクチン ESCRT 依存ソート処理の可能な役割は知られていない、F アクチンは ECV/MVBs の生合成におけるや早期エンドソームを超えて輸送に重要な役割を果たしています。特に、アネキシン A2 初期エンドソームと spire1 と共にコレステロール濃縮の領域にバインド、nucleates F アクチンの重合がわかった。エンドソームに観察される分岐アクチン ネットワークの形成がアクチン関連タンパク質 (ARP) 2/3 の分岐のアクティビティを必要とする複雑でと同様、ERM タンパク質モエシン、アクチン結合タンパク質 cortactin8,9。
ここでは、核生成と試験管内初期エンドソーム膜に F-アクチンの重合を再構成培養顕微鏡ベースのアッセイをについて説明します。この試金は、A2 を F-アクチン核形成におけるアネキシンとモエシンとエンドソーム アクチン ネットワーク8,9の形成の役割を調べるため以前使用されています。この体外プロトコルで複雑な一連のエンドソームでアクチンの重合時に発生する反応なるアクチン核形成、線形を含むプロセスの一連のステップの生化学的および分子の分析に従う義務があります。重合、分岐、および架橋。
Protocol
Representative Results
Discussion
アクチンは、エンドソーム膜ダイナミクス4,14の重要な役割を果たしています。我々 はアクチン核形成と重合では、初期エンドソーム小 F アクチン パッチやネットワーク形成を報告しました。これら F アクチン ネットワークがを超えて分解経路に沿って早期エンドソーム膜輸送のため絶対に必要です。この核と重合プロセスのすべてのステップに?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
スイス国立科学財団からの支援を得てください。スイスの Sinergia プログラム;ポーランド語-スイスのリサーチ ・ プログラム (PSPB-094/2010)化学生物学の国立がんスイス SystemsX.ch イニシアティブから LipidX (j. g.) にスイスの全米科学財団によって評価されます。O. m. は、エンボ長期フェローシップ (ALTF-516-2012) によって支えられました。
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22um | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-ml polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18X18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μl yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1000-μl Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-ml test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
Riferimenti
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