생체 외에서 F-말라 초기 Endosomes에의 합
Summary
초기 endosome 함수 F 말라 합에 따라 달라 집니다. 여기, 우리가 설명 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 반응의 복잡 한 시리즈가 생화학 및 유전 의무가 렌더링 조작입니다.
Abstract
많은 초기 endosome 기능, 특히 화물 단백질 정렬 및 막 변형, endosomal 막에 nucleated 짧은 F 걸 필 라 멘 트의 따라 달라 집니다. 우리는 설립 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 의무가 유전 그리고 생 화 확 적인 반응의이 복잡 한 시리즈를 렌더링 조작입니다. Endosomal 분수 부양 초기 endosomal 단백질 GFP RAB5을 표현 하는 세포에서 자당 기온 변화도에 의해 준비 된다. Cytosolic 분수 셀의 별도 일괄 처리에서 준비 된다. Endosomal와 cytosolic 분수 저장할 수 있습니다 액체 질소에서 냉동 필요한 경우. 분석 결과, endosomal와 cytosolic 분수, 혼합 한 혼합물은 적절 한 조건 (예를 들어, 이온 강도, 감소 환경)에서 37 ° C에서 알을 품을. 원하는 시간에 반응 혼합물을 고정 하 고 F 걸 phalloidin로 드러났습니다. 말라 nucleation와 중 합 후 형광 현미경 검사 법에 의해 분석 된다. 여기, 우리는이 분석 결과 말라 nucleation 막, 또는 후속 신장, 분기, 또는 F 걸 필 라 멘 트의 가교에 관련 된 요인의 역할을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다 보고 합니다.
Introduction
높은 진 핵 세포, 단백질 및 지질 초기 endosomes 정렬이 발생 하는 위치에 내 면 됩니다. 일부 단백질과 지질, reutilized 될 운명, 초기 endosomes의 관 지역에 통합은 그리고 그 때 수송 된다 원형질 막 또는 trans Golgi 네트워크 (TGN)1,2. 대조적으로, 다른 단백질과 지질 선택적으로 multivesicular 모양을 전시 초기 endosomes의 지역에 포장 됩니다. 이 지역 확장 하 고, 초기 endosomal 막에서 분리, 시 무료 endosomal 캐리어 소포 또는 multivesicular 시체 (ECV/MVBs), 결국 성숙한는 늦은 endosomes1, 으로 화물 운송에 대 한 책임 2.
말라는 endosomal 정렬 용량과 endosome 속과 관련 된 막 개장 과정에서 중요 한 역할을 한다. 원형질 막 또는 TGN 재활용 경로 따라 정렬 단백질 복잡 한 retromer와 관련 된 단백질에 따라 달라 집니다. 이 정렬 기계 재활용 tubules 통해 상호 작용의 복잡 한, retromer의 말 벌 및 흉터 homologue (세척) 복잡 하 고 분기 말라3,4,5 형성에 결합 될 것 . 반면, 분자 저하에 대 한 운명, 특히 신호 수용 체 활성화, endosomal 단지 전송 (ESCRT)2,6,에 필요한 정렬 정렬할 intraluminal 소포 (ILVs)으로 7. ESCRT-종속 정렬 과정에서 말라의 가능한 역할을 알 수 없습니다 하는 동안 F-걸 ECV/MVBs의 속에 그리고 이른 endosomes 넘어 전송에 중요 한 역할을 재생 합니다. 특히, 우리 콜레스테롤 풍부한 지역 초기 endosome의 spire1 함께 바인딩합니다 annexin A2, F-말라 합 nucleates 발견. Endosomes에서 분기 말라 네트워크의 형성 필요 걸 관련 단백질 (ARP) 2/3의 분기 활동, 복합 음 단백질 moesin 고 말라-바인딩 단백질 cortactin8,9.
여기, 우리가 시험관에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 시험관에서 이른 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 설명 합니다. 이 분석 결과 이전 F-말라 nucleation에서 A2 annexin의 moesin 및 cortactin endosomal 걸 네트워크8,9의 형성에의 역할을 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 이 생체 외에서 프로토콜 말라 합 동안 endosomes에 발생 하는 반응의 복잡 한 시리즈 될 걸 nucleation, 선형을 포함 하 여 과정의 순차적 단계의 생 화 학적 및 분자 분석에 순종 중 합, 분기, 고 가교입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
말라는 endosome 막 역학4,14에서 중요 한 역할을 한다. 우리 이전 보고 말라 nucleation 및 중 합 초기 endosomes에 발생 작은 F 걸 패치 또는 네트워크 형성. 이러한 F-말라 네트워크는 초기 endosomes 저하 통로 넘어 막 전송 절대적으로 필요 합니다. 이 nucleation 및 중 합 프로세스의 어떤 단계에서 방해 endosome 성숙 및 따라서 늦은 endosomes andlysosomes9…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
스위스 국립 과학 재단;에서 지원 받은 스위스 Sinergia 프로그램; 폴란드어-스위스 연구 프로그램 (PSPB-094/2010); 화학 생물학; NCCR 그리고 스위스 SystemsX.ch 이니셔티브에서 LipidX (J. G.)에 스위스 국립 과학 재단에 의해 평가. O. M. EMBO 장기 친교 (ALTF-516-2012)에 의해 지원 되었다.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22um | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-ml polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18X18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μl yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1000-μl Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-ml test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
Riferimenti
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