Live-celle måling af lugtstof Receptor aktivering ved hjælp af en Real-time lejr Assay
Summary
Kendetegner funktionen af lugtstof receptorer serverer en uundværlig del i deorphanization-processen. Vi beskriver en metode til at måle aktivering af lugtstof receptorer i realtid ved hjælp af en lejr assay.
Abstract
De enorme størrelser af pattedyr lugtstof receptor (OR) familier vanskeligheder at finde deres beslægtet ligander blandt talrige flygtige kemikalier. Hvis du vil effektivt og præcist deorphanize ORs, kombinerer vi brug af en heterolog cellelinie udtrykke pattedyr ORs og en genetisk modificerede biosensor plasmid for at måle cAMP produktion nedstrøms OR aktivering i realtid. Denne analyse kan bruges til skærm Duftenes mod ORs og vice versa. Positive lugtstof receptor interaktioner fra skærmene kan senere bekræftet ved at teste mod forskellige lugt koncentrationer, generere koncentration-respons-kurver. Her brugte vi denne metode til at udføre en høj overførselshastighed screening af en lugtende sammensatte mod menneskelige OR bibliotek udtrykt i Hana3A celler og bekræftet, at de positivt reagerer receptor er beslægtet receptoren for sammensat af interesse. Vi fandt denne høj overførselshastighed påvisningsmetode skal være effektiv og pålidelig vurdering af OR aktivering og vores data giver et eksempel på dets potentielle anvendelse i OR funktionelle studier.
Introduction
Lugtesansen spiller en vigtig rolle i dyrenes overlevelse, som de er afhængige af deres olfaktoriske evner at få mad, undgå rovdyr og fare, skelne arter og vælg mate1,2. Realiseringen af disse funktioner afhænger af lugtstof receptorer (ORs), som er individuelt udtrykt ved ciliaere overfladen af olfaktoriske sensoriske neuroner (OSNs) beliggende i Lugtepithelet (OE). ORs udgør den største familie af G-protein koblet receptor (GPCR) superfamilien med ca 400 og 1200 forskellige OR gener i mennesker og mus, henholdsvis3,4,5. ORs aktiveres af Duftenes føre til øget intracellulære cAMP niveau via den sekventielle aktivering af olfaktoriske G-protein (Golf) og type III adenylyl cyclase (ACIII). Den deraf følgende øget niveau af intracellulære cAMP kunne fungere som en anden budbringer, som åbner den nukleotid-gated kanal på celleoverfladen, udløser tilstrømning af kationer herunder Ca2 + og handling potentialer, og i sidste ende indlede Neuro-potentiale transmission og olfaktoriske perception. Processen med at opdage og diskriminere en lang række duftstoffer af ORs betragtes som det første skridt af olfaktoriske perception6,7.
Da Buck og Axel8 først med succes klonet lugtstof receptorer og belyst mekanisme af olfaktoriske perception initieret af ORs, blev deorphanization af familien OR en af hotspots i dette felt. Forskellige in vivo, ex vivo og in vitro- metoder til at måle OR aktivering har været rapporteret9,10,11,12. En traditionel metode, der bruges Ca2 + imaging efterfulgt af encellede RT-PCR på OSNs aktiveret identifikation af forskellige ORs til alifatiske Duftenes13,14,15. Mere nylig, fremkomsten af store transkriptom analyser fremmet udviklingen af mere høj overførselshastighed i vivo metoder. Kentucky analysen identificeret eugenol – og muscone-responderende mus ORs med brug af S100a5-tauGFP reporter mus stamme og microarray analyse9. Baseret på faldet i OR mRNA niveau efter lugtstof eksponering, ansat drøm teknologi en transkriptom tilgang til at bestemme OR aktivering profiler i begge hvirveldyr og ikke-hvirveldyr arter16. Ligeledes givet fosforylering af S6 i neuronal aktiveringer, Matsunami gruppe sekventeret mRNAs fra fosforyleres ribosomet immunoprecipitations til at identificere lydhør ORs12. Endelig vil rapporteret gruppen Feinstein super sniffer mus, der kunne tjene som en platform til at studere lugt kodning i vivo, kendt som MouSensor teknologi17.
I in vitro- rige gør udfordring af dyrkning OSNs en heterolog ekspressionssystem, der efterligner OR funktionelle udtryk i vivo er ideel til at gennemføre omfattende screening af lugtende kemikalier til ORs. Ikke desto mindre, da kulturperler cellelinjer af ikke-olfaktoriske oprindelse afviger fra indfødte OSNs eller proteiner er bevaret i det endoplasmatiske reticulum og ude af stand til trafik til plasma membran, resulterer i OR forringelse og tab af receptor funktion18 , 19. for at løse dette problem, omfattende værker har gjort for at replikere OR funktionelle udtryk på cellemembranen i heterolog cellelinjer. Krautwurst et al. først knyttet de første 20 aminosyrer af rhodopsin (Rho-tag) til N-terminalen OR protein og dette forfremmet celle-overflade udtryk for nogle ORs i menneskelige embryonale nyre (HEK) celler20. Ved at gennemføre en serie analyse af genet udtryk (SAGE) bibliotek analyse fra enkelt OSNs Saito mfl. første klonede en receptor-transport protein (RTP) familiemedlemmer, RTP1 og RTP2 og receptor udtryk enhancer protein 1 (REEP1), der lettere OR handel til cellemembranen og forbedret lugtstof-medieret svar af ORs i HEK293T celler 21. baseret på disse resultater, Matsunami gruppen oprettet Hana3A-cellelinie, stabilt transfekteret med RTP1, RTP2, REEP1 og Gαolf i HEK293T, og forbigående transfekteret med Rho-tagged ORs, effektiv eller funktionelle udtryk. Efterfølgende undersøgelser viste 1) en kortere form af RTP1, RTP1S, der kunne mere håndfast fremmer eller funktion end den oprindelige RTP1 protein og 2) den type 3 muskarine acetylcholin-receptor (M3R), der kunne forbedre OR aktivitet via hæmning af β-arrestin-2 rekruttering, som begge blev indført Heterolog ekspression systemet for at optimere eksperimentelle output22,23.
Flere metoder til påvisning er blevet brugt til at kvantificere receptor aktivering i heterolog systemer. Udskilles placenta alkalisk fosfatase (SEAP) analysen arbejder med en reporter enzym transcriptionally reguleret af cAMP svar elementer (CREs), hvilket gør det til en attraktiv mulighed for at vurdere OR aktivering. Fluorescens opdages let i en stikprøve af næringssubstratet efter inkubation med SEAP påvisning reagens24. Brug denne metode, karakteriseret funktioner af ORs samt en sekundær klasse af chemosensory receptorer udtrykt i OE-the sporingen Amin-associerede receptorer (TAARs) har været25,26,27. En anden fælles metode, luciferase assay, bruger en firefly luciferase reporter gen under kontrol af elementet lejr svar (CRE). Måling luminescence genereret af luciferase produktion giver en effektiv og robust måde af kvantificere OR aktivering10,11,28.
Real-time lejr assays har også været meget anvendt i dynamisk overvågningsfunktion heterolog eller endogene GPCRs. Et eksempel på sådanne avancerede assays drager fordel af en genetisk kodet biosensor variant, som besidder en cAMP-bindende domæne smeltet til en mutant form af luciferase. Når lejren binder, fører en konformationel ændring til aktivering af luciferase, luminescence hvorfra kan derefter måles med en kemiluminescens læser29,30. Den real-time lejr teknologi er blevet rapporteret egnet til de forældreløse af menneskelige lugtstof receptorer i HEK293 og NxG 108CC15 cellerrøv = “xref” > 31,32,33, som såvel som i den HEK293T-afledte Hana3A celler34,35. Gruppen Krautwurst også beskrevet i detaljer i realtid lejr teknologi for at være egnet til bi-directional storstilet eller screening tilgange32,33.
Her beskriver vi en protokol til måling af OR aktivering ved hjælp af en real-time lejr assay i Hana3A celler. I denne protokol måles luminescence pre afbalancerede levende celler kinetically for 30 min efter behandlingen med specifikke flygtige forbindelser, der repræsenterer en mere effektiv og præcis analyse af OR aktivering, der er mindre modtagelige for artefakter, der forekommer i den cellulære miljø med længere tid og lugt-induceret celle toksicitet. Denne real-time måling giver mulighed for en omfattende screening af ORs og ligander, samt karakterisering af specifikke OR-ligand par af interesse. Brug denne metode, identificeret vi med held OR5AN1 som receptoren for moskus sammensatte muscone ved at udføre en screening mod 379 menneskelige ORs og efterfølgende bekræfter positive screening resultatet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Præcist måle en OR aktivering ved udsættelse for en bestemt lugtstof er det første skridt i afkodning af kodning af olfaktoriske oplysninger. Forsøgene vist i denne undersøgelse, er et eksempel på hvordan man kan identificere, ved hjælp af en in vitro- OR ekspressionssystem, lydhør ORs blandt de menneskelige OR repertoire af lugtende kemikaliet interesse og efterfølgende kendetegner receptoren farmakologi ved hjælp af forskellige koncentrationer af kemikaliet. Vores resultater bekræfter OR5AN1 som en…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet var støttet af de kinesiske National Science Foundation (31070972), videnskab og teknologi Kommissionen af Shanghai kommune (16ZR1418300), programmet for Innovative forskning Team i Shanghai Municipal uddannelse Kommissionen, Shanghai østlige Scholar Program (J50201), og programmet nationale grundforskning af Kina (2012CB910401).
Materials
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Gibco | 10099-141 | |
| GloSensor cAMP reagent | Promega | E1290 | |
| pGloSensor-20F cAMP plasmid | Promega | E1171 | |
| Hana3A cells | available from authors upon request | ||
| HBSS, w/o calcium chloride and magnesium chloride | GIBCO | 14175095 | |
| HEPES | Hyclone | SH30237 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| M3R plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| MEM, w/EBSS and w/L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
| Muscone | Santa Cruz | sc-200528 | |
| Musk tibetene | Sigma-Aldrich | S359165 | |
| OR plasmids | cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| PBS, w/o calcium or magnesium | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | |
| RTP1S plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
| 0.2-mL PCR tube | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5-mL Eppendorf tube | Eppendorf | ||
| 15-mL 17 mm x 120 mm conical tube | BD Falcon | 352096 | |
| 8-well and/or 12-well multichannel pipetman | Eppendorf | ||
| 96-well flat-bottomed white cell culture plate | Greiner | 655098 | |
| 100 mm x 20 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| Class II biological safety cabinet with laminar flow | |||
| Cell culture incubator, w/ 5% CO2 | |||
| Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes | |||
| Infinite F200 plate reader | Tecan | ||
| Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution | |||
| Sterile paper towel |
Riferimenti
- Malakoff, D. Following the scent of avian olfaction. Science. 286 (5440), 704-705 (1999).
- Zippel, H. P. The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8. Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).
- Dryer, L., Berghard, A. Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Reed, R. R. After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction. Cell. 116 (2), 329-336 (2004).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- McClintock, T. S., et al. In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors. J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).
- Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity. J. Vis. Exp. (88), e51640 (2014).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal. 2 (60), ra9 (2009).
- Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- von der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).
- D’Hulst, C., et al. MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding. Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).
- Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Sci Signal. 4 (155), ra1 (2011).
- Durocher, Y., et al. A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture. Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).
- Liberles, S. D., Buck, L. B. A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium. Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).
- Saraiva, L. R., et al. Combinatorial effects of odorants on mouse behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).
- Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium. J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).
- Fan, B. F., Wood, K. V. Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications. Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).
- Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors. J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).
- Noe, F., et al. OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol. Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).
- Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).
- Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).
- Li, S., et al. Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols. J Am Chem Soc. , (2016).
- Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps. J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).
- Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
- Block, E., et al. Implausibility of the vibrational theory of olfaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).
- Sato-Akuhara, N., et al. Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection. J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).
- Gane, S., et al. Molecular vibration-sensing component in human olfaction. PLoS One. 8 (1), e55780 (2013).
- Young, J. M., et al. Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families. Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).
