Live-cell mätning av luktämnet Receptor aktiveringen med en realtid cAMP-analys
Summary
Karaktärisera funktionen av luktämnet receptorer serverar en oumbärlig del i processen deorphanization. Vi beskriver en metod att mäta aktivering av luktämnet receptorer i realtid med en cAMP-analys.
Abstract
De enorma storlekarna av de nuvarande svårigheterna för däggdjur luktämnet receptor (OR) familjer att hitta deras cognate ligander bland många flyktiga kemikalier. För att effektivt och korrekt deorphanize ORs, kombinera vi användningen av ett heterologt cellinje uttrycka däggdjursceller ORs och en genetiskt modifierade biosensor plasmid för att mäta cAMP produktion nedströms OR Activation i realtid. Denna analys kan användas för att skärmen odoranter mot ORs och vice versa. Positiv luktreceptor interaktioner från skärmarna därefter kan bekräftas genom att testa mot olika lukt koncentrationer, generera koncentration-respons kurvor. Här använde vi denna metod för att utföra en high-throughput screening av en illaluktande förening mot en mänsklig OR bibliotek uttryckt i Hana3A celler och bekräftat att positivt-svarar receptorn är besläktat receptorn för sammansatta av intresse. Vi hittade denna hög genomströmning detektionsmetod vara effektiv och tillförlitlig bedömning av OR aktivering och våra data ger ett exempel på dess potentiella användning i OR funktionella studier.
Introduction
Luktsinnet spelar en viktig roll i djurens överlevnad eftersom de förlitar sig på sin lukt förmåga att skaffa föda, undvika rovdjur och fara, skilja arter och välj mate1,2. Förverkligandet av dessa funktioner beror på luktämnen receptorer (ORs), som uttrycks individuellt vid strålkroppen ytan av lukt sensoriska nervceller (OSNs) ligger i luktepitel (OE). ORs utgör den största familjen av G-protein kopplade receptorer (GPCR) superfamiljen med ungefär 400 och 1200 olika OR gener i mänskliga och mus, respektive3,4,5. ORs aktiveras av odoranter leda till ökade intracellulära cAMP-nivåerna via sekventiell aktivering av lukt G-protein (Golf) och typ III viktreglerande cyclase (ACIII). Den resulterande ökad nivån av intracellulära cAMP kunde fungera som en andra budbärare, som öppnar nukleotid-gated kanal på cellytan, utlöser tillströmning av katjoner inklusive Ca2 + och handlingspänningar, och slutligen inleda neuro-potential överföring och lukt perception. Processen för att upptäcka och diskriminera ett stort antal doftämnen av ORs betraktas som det första steget av lukt perception6,7.
Eftersom Buck och Axel8 först framgångsrikt klonat luktämnet receptorer och klarlagd mekanismen av lukt perception initierats av ORs, blev deorphanization OR familjen en av hotspots i fältet. Olika i vivo, ex vivo och in vitro- metoder att mäta OR aktiveringen har varit rapporterade9,10,11,12. En traditionell metod som används Ca2 + imaging följt av encelliga RT-PCR på OSNs aktiverat identifiering av olika ORs till alifatiska odoranter13,14,15. Mer nyligen, tillkomsten av storskaliga transkriptom analyser främjas utvecklingen av mer hög genomströmning i vivo metoder. Kentucky analysen identifieras eugenol – och muscone-lyhörd mus ORs med användning av S100a5-tauGFP reporter mus stam och microarray analys9. Den dröm-tekniken baserat på minskningen av OR mRNA nivåer efter luktämnet exponering, och anställd en transcriptomic strategi att bestämma OR aktiveringen profiler i både ryggradsdjur och icke-ryggradsdjur arter16. Likaså ges fosforyleringen av S6 i neuronala aktiveringar, Matsunami gruppen sekvenserade mRNA från fosforyleras Ribosomen immunoprecipitations att identifiera lyhörd ORs12. Slutligen rapporterade gruppen Feinstein super sniffer möss som kan fungera som en plattform för att studera lukt kodning i vivo, kallas den MouSensor teknik17.
I in vitro- sfären gör utmaningen att odla OSNs ett heterologt uttryck system som härmar OR funktionella uttryck i vivo en idealisk lösning att bedriva storskalig screening av illaluktande kemikalier för ORs. Ändå, eftersom odlade cellinjer av icke-lukt ursprung skiljer sig från infödda OSNs, eller proteiner behålls i endoplasmatiska retiklet och oförmögen att trafiken till plasmamembranet, vilket resulterar i OR försämringen och förlusten av receptor funktion18 , 19. för att lösa problemet, omfattande arbeten har gjorts att replikera OR funktionella uttryck på cellmembranet i heterologa cellinjer. Krautwurst et al. först bifogas de första 20 aminosyrorna av rhodopsin (Rho-tagg) N-terminalen av OR protein och detta främjas cellytan uttrycket av vissa ORs i mänskliga embryonala njurar (HEK) celler20. Genom att bedriva en seriell analys av gen uttryck (SAGE) bibliotek analys från enda OSNs, Saito et al. första klonade receptor-transporterar protein (RTP) familjemedlemmar, RTP1 och RTP2 och receptor uttryck enhancer protein 1 (REEP1) som underlättat OR människohandel till cellmembranet och förbättrat luktämnet-medierad Svaren av ORs i HEK293T celler 21. baserat på dessa fynd, gruppen Matsunami framgångsrikt etablerat raden Hana3A cell, stabilt transfekterade med RTP1, RTP2, REEP1 och Gαolf i HEK293T och övergående transfekterade med Rho-taggade ORs, för effektiv eller funktionella uttryck. Senare studier visade 1) en kortare form av RTP1, RTP1S, som mer kraftfullt kan främja eller funktion än det ursprungliga RTP1 proteinet och 2) typ 3 muskarina acetylkolin receptorn (M3R) som skulle kunna förbättra OR aktiviteten via hämning av β-arrestin-2 rekrytering, vilka båda infördes till heterologa uttryck systemet för att optimera experimentella utgång22,23.
Flera identifieringsmetoder har använts för att kvantifiera receptor aktiveringen i heterologa system. Utsöndras via placenta alkaliskt fosfatas (SEAP) analysen fungerar med en reporter enzym transcriptionally regleras av cAMP svar element (CREs), vilket gör det till ett attraktivt alternativ för att bedöma OR aktivering. Fluorescensen upptäcks lätt i ett prov av odlingssubstratet efter inkubering med SEAP upptäckt reagens24. Med den här metoden kännetecknas fungerar av ORs samt en sekundär klass av chemosensory receptorer uttrycks i OE-the spårningen amine-associerade receptorer (TAARs) har varit25,26,27. En annan vanlig metod, luciferas analysen, använder en firefly luciferas reporter gen under kontroll av elementet cAMP svar (CRE). Mäta luminiscens genereras av luciferas produktion erbjuder ett effektivt och robust sätt att kvantifiera OR aktiveringen10,11,28.
Realtid cAMP analyser har också använts i dynamiskt övervakning funktionen av heterologa eller endogena varandra. Ett exempel på sådana avancerade analyser tar fördel av en genetiskt kodade biosensor variant, som äger en cAMP-bindande domän smält till en muterad form av luciferas. När lägret binder, leder conformationaländring till aktivering av luciferas, luminiscens som sedan kan mätas med en chemiluminescence läsaren29,30. Realtid cAMP tekniken har rapporterats passar den de föräldralösa av mänskliga luktämnet receptorer i HEK293 och NxG 108CC15 cellerAss = ”xref” > 31,32,33, som liksom den HEK293T-derived Hana3A celler34,35. Krautwurst gruppen också beskrivs i detalj i realtid cAMP tekniken för att vara lämplig för dubbelriktad storskalig eller screening metoder32,33.
Här beskriver vi ett protokoll för att mäta OR aktivering med en realtid cAMP-analys i Hana3A celler. I detta protokoll mäts luminiscens pre skakad levande celler kinetiskt för 30 min efter behandling med specifika flyktiga föreningar, som representerar en mer effektiv och korrekt analys av OR aktivering som är mindre känsliga för artefakter som förekommer i den cellulära miljön med längre tid och lukt-inducerad cell toxicitet. Denna realtid mätning möjliggör en storskalig undersökning av både ORs och ligander, samt karakterisering av specifika OR-ligand par av intresse. Med den här metoden identifierat vi framgångsrikt OR5AN1 som receptorn för den mysk sammansatta muscone-genom att utföra en screening mot 379 mänskliga ORs och därefter bekräftar positiv screening resultatet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Exakt mätning en eller aktivering vid exponering för en viss luktämnet är det första steget i dechiffrera kodningen av lukt information. I experiment visat i denna studie utgör ett exempel på hur man kan identifiera, använder en in vitro- OR uttryck systemet, lyhörd ORs bland den mänskliga OR repertoaren för den illaluktande kemiskt av intresse och därefter kännetecknar receptorn farmakologi med olika koncentrationer av kemikalien. Våra resultat bekräftar OR5AN1 som en bona fide -receptor…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet stöddes av kinesiska National Science Foundation (31070972), vetenskap och teknik kommissionen i Shanghai kommun (16ZR1418300), programmet för innovativ forskning Team av Shanghai kommunala utbildningskommissionen, Shanghai östra Scholar Program (J50201), och programmet nationella grundforskning av Kina (2012CB910401).
Materials
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Gibco | 10099-141 | |
| GloSensor cAMP reagent | Promega | E1290 | |
| pGloSensor-20F cAMP plasmid | Promega | E1171 | |
| Hana3A cells | available from authors upon request | ||
| HBSS, w/o calcium chloride and magnesium chloride | GIBCO | 14175095 | |
| HEPES | Hyclone | SH30237 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| M3R plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| MEM, w/EBSS and w/L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
| Muscone | Santa Cruz | sc-200528 | |
| Musk tibetene | Sigma-Aldrich | S359165 | |
| OR plasmids | cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| PBS, w/o calcium or magnesium | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | |
| RTP1S plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
| 0.2-mL PCR tube | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5-mL Eppendorf tube | Eppendorf | ||
| 15-mL 17 mm x 120 mm conical tube | BD Falcon | 352096 | |
| 8-well and/or 12-well multichannel pipetman | Eppendorf | ||
| 96-well flat-bottomed white cell culture plate | Greiner | 655098 | |
| 100 mm x 20 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| Class II biological safety cabinet with laminar flow | |||
| Cell culture incubator, w/ 5% CO2 | |||
| Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes | |||
| Infinite F200 plate reader | Tecan | ||
| Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution | |||
| Sterile paper towel |
Riferimenti
- Malakoff, D. Following the scent of avian olfaction. Science. 286 (5440), 704-705 (1999).
- Zippel, H. P. The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8. Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).
- Dryer, L., Berghard, A. Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Reed, R. R. After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction. Cell. 116 (2), 329-336 (2004).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- McClintock, T. S., et al. In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors. J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).
- Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity. J. Vis. Exp. (88), e51640 (2014).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal. 2 (60), ra9 (2009).
- Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- von der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).
- D’Hulst, C., et al. MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding. Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).
- Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Sci Signal. 4 (155), ra1 (2011).
- Durocher, Y., et al. A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture. Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).
- Liberles, S. D., Buck, L. B. A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium. Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).
- Saraiva, L. R., et al. Combinatorial effects of odorants on mouse behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).
- Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium. J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).
- Fan, B. F., Wood, K. V. Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications. Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).
- Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors. J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).
- Noe, F., et al. OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol. Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).
- Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).
- Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).
- Li, S., et al. Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols. J Am Chem Soc. , (2016).
- Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps. J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).
- Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
- Block, E., et al. Implausibility of the vibrational theory of olfaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).
- Sato-Akuhara, N., et al. Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection. J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).
- Gane, S., et al. Molecular vibration-sensing component in human olfaction. PLoS One. 8 (1), e55780 (2013).
- Young, J. M., et al. Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families. Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).
