Genom-bred kortlægning af protein-DNA-interaktioner med ChEC-seq in<em> Saccharomyces cerevisiae</em

Summary

Vi beskriver chromatin endogen spaltning kombineret med høj gennemstrømningssekvensering (ChEC-seq), en chromatinimmunpræcipitation (ChIP) -orthogonal metode til kortlægning af proteinbindingssteder, som er genomsamlede med mikrokocelle nuklease (MNase) fusionsproteiner.

Abstract

Genomfattende kortlægning af protein-DNA-interaktioner er kritisk for forståelse af genregulering, chromatin-remodeling og andre chromatin-residente processer. Formaldehyd-tværbinding efterfulgt af chromatinimmunpræcipitation og høj-gennemstrømningssekvensering (X-ChIP-seq) er blevet anvendt til at opnå mange værdifulde indsigter i genombiologi. Imidlertid har X-ChIP-seq bemærkelsesværdige begrænsninger forbundet med tværbinding og sonikering. Native ChIP undgår disse ulemper ved at udelade tværbinding, men resulterer ofte i dårlig genopretning af kromatinbundne proteiner. Derudover er alle ChIP-baserede metoder underlagt antistofkvalitets overvejelser. Enzymatiske metoder til kortlægning af protein-DNA-interaktioner, der involverer fusion af et protein af interesse for et DNA-modificerende enzym, er også blevet anvendt til kortlægning af protein-DNA-interaktioner. Vi har for nylig kombineret en sådan metode, chromatin endogen spaltning (ChEC), med høj gennemstrømningssekvensering som ChEC-seq. ChEC-seq er afhængig af fusion af en chromatin-assocIeret protein af interesse for mikrokokernuklease (MNase) til dannelse af målrettet DNA-spaltning i nærværelse af calcium i levende celler. ChEC-seq er ikke baseret på immunpræcipitation og omgår således potentielle problemer med tværbinding, sonikering, chromatinopløseliggørelse og antistofkvalitet, samtidig med at der tilvejebringes højopløsningsmapping med minimalt baggrundssignal. Vi forestiller os, at ChEC-seq vil være en stærk modstykke til ChIP, hvilket giver et selvstændigt middel til at både validere ChIP-seq-fund og opdage nye indblik i genomisk regulering.

Introduction

Kortlægning af bindingsstederne for transkriptionsfaktorer (TF'er), chromatin-remodelerer og andre kromatinassocierede regulatoriske faktorer er nøglen til forståelsen af ​​alle kromatinbaserede processer. Mens chromatinimmunpræcipitation og høj gennemstrømningssekvensering (ChIP-seq) fremgangsmåder er blevet brugt til at opnå mange vigtige indsigter i genombiologi, har de bemærkelsesværdige begrænsninger. Vi introducerede for nylig en alternativ metode, kaldet chromatin endogen spaltning og high-throughput sekventering (ChEC-seq) ¹ , for at omgå disse ulemper.

ChIP-seq udføres oftest med et indledende formaldehydtværbindelsestrin (X-ChIP-seq) for at bevare protein-DNA-interaktioner. Imidlertid har en række nyere undersøgelser vist, at X-ChIP-seq fanger transient eller ikke-specifikke protein-DNA-interaktioner ^{2 , 3 , 4 , 5} <Sup>, ^{6 , 7 , 8} , hvilket giver anledning til falske positive bindingssteder. Hertil kommer, at sonikering, der almindeligvis anvendes til fragmentering af chromatin i X-ChIP-seq-eksperimenter, fortrinsvis saksregioner af åben chromatin, hvilket fører til forspændt opsving af fragmenter fra disse regioner ^{9 , 10} . Sonikering giver også en heterogen blanding af fragmentlængder, der i sidste ende begrænser bindingsstedets opløsning, selvom tilsætningen af ​​et exonukleasefordøjelsestrin i høj grad kan forbedre opløsningen ^{11 , 12} . Native ChIP-metoder såsom besatte regioner af genomer fra affinitetsrenset naturligt isoleret kromatin (ORGANISK) ¹³ bruger ikke tværbinding og fragmentkromatin med mikrokokernuklease (MNase), lindrende potentielle biaser forbundet med formaldehyd-tværbinding og sonikering. Imidlertid,Opløseligheden af ​​mange kromatinbundne proteiner under de forholdsvis milde betingelser, der kræves til nativ kromatinekstraktion er dårlig, hvilket potentielt fører til reduceret dynamisk område og / eller falske negativer ¹⁴ .

Mens forskellige iterationer af ChIP-seq mest anvendes til genomfattende kortlægning af protein-DNA-interaktioner, er der også implementeret adskillige kortlægningsteknikker baseret på fusion af proteiner af interesse for forskellige DNA-modificerende enzymer. En sådan fremgangsmåde er DNA-adeninmethyltransferaseidentifikation (DamID) ¹⁵ , hvor et chromatinbindende protein af interesse er genetisk fusioneret til Dam, og denne fusion udtrykkes i celler eller dyr, hvilket resulterer i methylering af GATC-sekvenser, der er proximale til bindingssteder for proteinet. DamID er fordelagtig, fordi den ikke er afhængig af immunpræcipitation og således undgår tværbinding, antistoffer eller chromatinopløseliggørelse. Det udføres også in vivo . Imidlertid, Er opløsningen af ​​DamID begrænset til kilobaseskalaen og den methylerende aktivitet af Dam-fusionsproteinet er konstitutiv. En anden metode baseret på enzymatisk fusion er Calling Card-seq ¹⁶ , der anvender fusion af en faktor af interesse for en transposase, der dirigerer stedsspecifik integration af transposoner. Som DamID er Calling Card-seq ikke baseret på immunpræcipitation og har dermed tilsvarende fordele, med den ekstra fordel ved forøget opløsning. Calling Card-seq kan imidlertid begrænses af sekvensforspændinger af transposaser og er også afhængig af tilstedeværelsen af ​​restriktionssteder tæt på transposon-insertionssteder.

En tredje enzymatisk fusionsmetode, der er udviklet i Laemmli lab, er chromatin endogen spaltning (ChEC) ¹⁷ . I ChEC udtrykkes en fusion mellem et chromatinassocieret protein og MNase i celler, og efter calciumtilsætning til aktivering af MNase spaltes DNA proximalt til bindingssteder for den mærketFaktor ( figur 1 ). I forbindelse med Southern blotting er ChEC blevet anvendt til at karakterisere chromatinstruktur og proteinbinding på et antal individuelle loci i gær ^{17 , 18} og er blevet kombineret med lavopløsnings-mikroarrayanalyse for at undersøge interaktionen mellem nukleare pore-komponenter med gæren Genom ¹⁹ . ChEC tilbyder fordele svarende til DamID og Calling Card-seq, og dens opløsning er næsten single-base pair, når den analyseres ved primer forlængelse ¹⁹ . ChEC er også kontrollerbar: Robust DNA spaltning ved MNase afhænger af tilsætning af millimolar calcium, hvilket sikrer, at MNase er inaktiv ved de lave frie calciumkoncentrationer observeret i levende gærceller ²⁰ .

Tidligere postulerede vi at kombinere ChEC med high-throughput-sekventering (ChEC-seq) ville tilvejebringe kort med høj opløsning af TF-bindingssteder. Faktisk, ChEC-seq genererede kort med høj opløsning af de spirende gær generelle regulatoriske faktorer (GRF'er) Abf1, Rap1 og Reb1 på tværs af genomet ¹ . Vi har også med succes anvendt ChEC-seq til det modulære Mediator-kompleks, en bevaret, essentiel global transkriptionel coaktivator ²¹ , der udvider anvendeligheden af ​​ChEC-seq til megadalton-størrelse komplekser, der ikke direkte kontakter DNA og kan være vanskelige at kortlægge ved ChIP- Baserede metoder. ChEC-seq er en stærk metode både til uafhængig validering af ChIP-seq-resultater og generering af nye indsigter i reguleringen af ​​chromatin-residente processer. Her præsenterer vi en trin-for-trin protokol til implementering af denne metode i spirende gær.

Protocol

1. Frembringelse af gærstammer Generer en gærstamme, der bærer den faktor af interesse, der er mærket med MNase. PCR amplificerer MNase-mærkningskassetten fra den ønskede vektor ( tabel 1 ) under anvendelse af den specificerede reaktionsblanding ( tabel 2 ) og cykliske betingelser ( tabel 3 ). Bland 5 μL af PCR-reaktionen og 1 μl 6X DNA-fyldstof. Kør hver PCR-alikvot på en 0,8% agarosegel ved 120 V i 40 minutter. Den forven…

Representative Results

I tilfælde af et vellykket ChEC-forsøg vil analyse af DNA ved agarosegelelektroforese afsløre en calciumafhængig forøgelse i DNA-fragmentering over tid som angivet ved udtværing og eventuel fuldstændig fordøjelse af genomisk DNA. I nogle tilfælde observeres en stige af bånd, der ligner den, der ses med en traditionel MNase-fordøjelse efter udvidet fordøjelse. Dette er tilfældet for ChEC analyse af Reb1, en generel regulatorisk faktor, der binder nukleosomudtømte regioner (N…

Discussion

Vi har vist, at ChEC kan kortlægge forskellige klasser af gærproteiner på kromatin og forudse, at det vil være bredt anvendeligt for forskellige familier af TF'er og andre kromatinbindende faktorer i gær. ChEC-seq er fordelagtig, idet den ikke kræver tværbinding, chromatinopløseliggørelse eller antistoffer. Således undgår ChEC artefakter, der potentielt er til stede i X-ChIP-seq, såsom hyper-ChIPable artefact ^{3 , 4} og native ChIP, såsom falske n…

Materials

dNTPs	NEB	N0447
Q5 high-fidelity DNA polymerase	NEB	M0491L	Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder	ThermoFisher Scientific	10488085
Taq DNA polymerase	NEB	M0273L
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	11836170001	It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+.
PMSF	ACROS Organics	AC215740010
Digitonin, High Purity	EMD Millipore	300410-250MG	Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.
Proteinase K, 20 mg/mL	Invitrogen	25530049
RNase A, 10 mg/mL	ThermoFisher Scientific	EN0531
Ampure XP beads	Beckman Coulter	A63880	Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).
MagneSphere magnetic rack	Promega	Z5342