دراسة مورفولوجيا القلب مشخصين وغذائها في الماوس
Summary
كثيرا ما يستخدم الفحص مشخصين في الفئران. وقد وضعت أجهزة الموجات فوق الصوتية ذات الدقة العالية باهظة الثمن لهذا الغرض. ويصف هذا البروتوكول إجراء مشخصين بأسعار معقولة جنبا إلى جنب مع تحليل شكلي نسيجية لتحديد مورفولوجيا القلب.
Abstract
عدد متزايد من نماذج الماوس المعدلة وراثيا قد أصبحت متاحة في السنوات الأخيرة. وعلاوة على ذلك، العدد الدراسات الدوائية في الفئران مرتفع. توصيف المظهرية من هذه النماذج الماوس يتطلب أيضا دراسة وظيفة القلب ومورفولوجيا. تخطيط صدى القلب، والتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) هي الأساليب المستخدمة شيوعاً لتوصيف وظيفة القلب ومورفولوجيا في الفئران. مشخصين والتصوير بالرنين المغناطيسي المعدات المتخصصة لاستخدامها في القوارض الصغيرة مكلفة وتتطلب مساحة مخصصة. ويصف هذا البروتوكول قياسات القلب في الفئران باستخدام نظام مشخصين سريرية مع تحقيق الأوعية الدموية بشرية 15 ميغاهيرتز. وتجري القياسات على تخديره من الفئران الكبار. ثلاثة على الأقل من تسلسل الصور وتسجل وتحليلها لكل الحيوانات في وضع M في عرض قصير-محور باراستيرنال. بعد ذلك، يتم إجراء الفحص النسيجي القلب، ويتم تحديد أقطار كارديوميوسيتي على الهيماتوكسيلين-agglutinin ويوزين-أو جنين القمح (WGA)-الملون مقاطع البارافين. وتبلغ كثافة السفينة مورفوميتريكالي العزم بعد إيمونوستينينج بيكم-1. البروتوكول قد تم تطبيقها بنجاح على الدراسات الدوائية ومختلفة الوراثية الحيوانية نماذج تحت ظروف خط الأساس، وكذلك بعد تجريبي احتشاء عضلة القلب بربط دائم (الشريان التاجي تنازلي الأمامي الأيسر الفتى). في تجربتنا، مشخصين التحقيق يقتصر على الحيوانات تخديره وعملياً في الفئران الكبار وزنها على الأقل 25 غراما.
Introduction
وتتوفر مجموعة كبيرة ومتنوعة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا، وعدد الدراسات الدوائية في الفئران عالية1،2. تخطيط صدى القلب، والتصوير بالرنين المغناطيسي هي النهج الشائع استخدامها لتوصيف وظيفة القلب ومورفولوجيا في هذه النماذج الماوس3المظهرية. وهدف البروتوكول المقدم تحليل وظيفة القلب ومورفولوجيا في الفئران الكبار. فهو يجمع بين مشخصين، النسيجي، وقياسات المناعي. فحص مشخصين يستخدم على نطاق واسع في الفئران4،5،،من67،،من89،10،11، 12. باشون et al. وحدد 11 205 الدراسات المنشورة في تداولو تعميم البحوثو المجلة الأمريكية الفسيولوجيا-القلب والدورة الدموية علم وظائف الأعضاءو أبحاث القلب والأوعية الدموية بين 2012 و 2015 أن ويستخدم فحص مشخصين في الحيوانات.
يتم استخدام تخطيط صدى القلب لتعريف تعمل القلب في الفئران المعدلة وراثيا5،6،،من1314،،من1516، 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22، فضلا عن تحليل وظيفة القلب في تضخم المزمنة الناجمة عن الحمل الزائد، واحتشاء عضلة القلب الاسكيمية، ونماذج اعتلال عضلة القلب في الفئران (استعرض في12). تسمح معدات تحسين تخطيط صدى القلب لهذا الإجراء القياسي البطين الأيسر (LV) الانقباضي والانبساطي الأبعاد وتصوير دوبلر الأنسجة، شعاعية التباين احتشاء عضلة القلب، وتقييم وظيفة LV الإقليمية ومحمية التاجي 12-ومن الناحية المثالية، ينبغي إجراء دراسة مشخصين في الفئران واعية لتجنب الآثار السلبية للتخدير في تقلص وظيفة، مراقبة المنعكس اللاإرادي، ومعدل القلب11. ومع ذلك، يقتصر هذا النهج بشرط لتدريب الحيوانات؛ صعوبات في الحفاظ على درجة حرارة الجسم ثابتة؛ التحف الحركة؛ الإجهاد؛ ترددات عالية جداً في القلب؛ والحاجة إلى مالا يقل عن اثنين من المحققين لإجراء التجربة، لا سيما إذا كان يجري التحقيق في عدد كبير من الحيوانات. من المثير للاهتمام، أفادت دراسة أجريت مؤخرا لا توجد فروقات في معلمات مشخصين في الحيوانات المدربة وغير المدربة19. ونحن أداء قياسات مشخصين في تخديره من الفئران. التخدير مختلف البروتوكولات ستناقش أدناه.
على الرغم من أن الدقة القياسية تخطيط صدى القلب (> 10 ميجاهرتز) هي كافية لتدبير LV الانقباضية وأبعاد االنقباضي ووظيفة القلب في الفئران الكبار، الطريقة محدودة في وصف الظواهر الهيكلية الكامنة وراء. وهكذا، أن نجمع بين القياسات في فيفو مع غذائها وتحاليل إيمونوهيستولوجيكال لقياس الكثافة القطر والسفينة كارديوميوسيتي، على سبيل المثال،. يمكن أيضا إجراء التحقيقات غذائها وإيمونوهيستولوجيكال الأخرى، مثل تحديد انتشار الأسلحة، ودراسة المبرمج، قياسات حجم احتشاء، تحديد التليف، والتعبير علامة محددة، على نفس النوع من معالجة الأنسجة ولكنها ليست موضوع هذا البروتوكول. ويوفر خليط في فيفو الفحص مشخصين بتحليلات النسيجي أفكاراً إضافية في التعديلات الهيكلية الكامنة. في خطوة إضافية، يمكن أن نكمل هذه القياسات مع التحقيقات الجزيئية وهيكلية فائقة. تحاليل نسيجية لا إكمال دراسة مشخصين بل أيضا أصبحت لا غنى عنها عندما حل ضربات القلب غير كافية. وهذا هو الحال خاصة في نماذج الفئران المعدلة وراثيا التي هي قاتلة الجنينية23،24.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وضعت أساليب مختلفة لتقييم هيكل القلب ووظيفة في الفئران، بما في ذلك تخطيط صدى القلب وتعزيز التباين التصوير بالرنين المغناطيسي والصغرى الأشعة المقطعية والحيوانات الأليفة مسح. نظراً للفعالية من حيث التكلفة والبساطة، تخطيط صدى القلب هو الأسلوب الأكثر استخداماً للتحليل الوظيفي في الفئر…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
العمل تدعمها “الحكومة الفرنسية” (الوكالة الوطنية للبحوث، والوكالة الوطنية للمعلومات) من خلال برنامج “الاستثمار من أجل المستقبل” سيجناليفي لابيكس (مرجع ANR-11-لابكس-0028-01) ومن المنح إلى ك. د. و من الرابطة صب sur la البحوث السرطان، مؤسسة دي فرانس، وخطة Inserm السرطان. د. ب ف أ-تلقي والزمالات من لوس أنجليس من أجل مؤسسة “بحوث ميديكال” ومن مدينة نيس، على التوالي. في اتشوكارديوجراف ومحول تم التكرم المقدمة من شركة فيليبس. ونحن نشكر بوردر ألف وديشتر س.، M. كوتاجار-بوسيرت، لاندوار أ، مارتريس أ، بيانكارديني أ وفاغنر م. س. لمساعداتها التقنية الماهرة.
Materials
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
Riferimenti
- Ormandy, E. H., Dale, J., Griffin, G. Genetic engineering of animals: ethical issues, including welfare concerns. Can Vet J. 52 (5), 544-550 (2011).
- Karl, T., Pabst, R., von Hörsten, S. Behavioral phenotyping of mice in pharmacological and toxicological research. Exp Toxicol Pathol. 55 (1), 69-83 (2003).
- Phoon, C. K., Turnbull, D. H. Cardiovascular Imaging in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 6 (1), 15-38 (2016).
- Wagner, N., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor beta stimulation induces rapid cardiac growth and angiogenesis via direct activation of calcineurin. Cardiovasc Res. 83 (1), 61-71 (2009).
- Wagner, K. D., Vukolic, A., Baudouy, D., Michiels, J. F., Wagner, N. Inducible Conditional Vascular-Specific Overexpression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Beta/Delta Leads to Rapid Cardiac Hypertrophy. PPAR Res. 2016, 7631085 (2016).
- Ghanbarian, H., et al. Dnmt2/Trdmt1 as Mediator of RNA Polymerase II Transcriptional Activity in Cardiac Growth. PLoS One. 11 (6), e0156953 (2016).
- Meguro, T., et al. Cyclosporine attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure. Circ Res. 84 (6), 735-740 (1999).
- de Araújo, C. C., et al. Regular and moderate aerobic training before allergic asthma induction reduces lung inflammation and remodeling. Scand J Med Sci Sports. 26 (11), 1360-1372 (2016).
- Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7 (7), e41691 (2012).
- Colazzo, F., et al. Murine left atrium and left atrial appendage structure and function: echocardiographic and morphologic evaluation. PLoS One. 10 (4), e0125541 (2015).
- Pachon, R. E., Scharf, B. A., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Best anesthetics for assessing left ventricular systolic function by echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (12), H1525-H1529 (2015).
- Gao, S., Ho, D., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Echocardiography in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 1, 71-83 (2011).
- Mor-Avi, V., et al. Current and evolving echocardiographic techniques for the quantitative evaluation of cardiac mechanics: ASE/EAE consensus statement on methodology and indications endorsed by the Japanese Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 24 (3), 277-313 (2011).
- Collins, K. A., Korcarz, C. E., Lang, R. M. Use of echocardiography for the phenotypic assessment of genetically altered mice. Physiol Genomics. 13 (3), 227-239 (2003).
- Rottman, J. N., Ni, G., Brown, M. Echocardiographic evaluation of ventricular function in mice. Echocardiography. 24 (1), 83-89 (2007).
- Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (5), H1938-H1945 (2001).
- Moran, C. M., Thomson, A. J., Rog-Zielinska, E., Gray, G. A. High-resolution echocardiography in the assessment of cardiac physiology and disease in preclinical models. Exp Physiol. 98 (3), 629-644 (2013).
- Fayssoil, A., Tournoux, F. Analyzing left ventricular function in mice with Doppler echocardiography. Heart Fail Rev. 18 (4), 511-516 (2013).
- Schoensiegel, F., et al. High throughput echocardiography in conscious mice: training and primary screens. Ultraschall Med. 32, S124-S129 (2011).
- Yariswamy, M., et al. Cardiac-restricted Overexpression of TRAF3 Interacting Protein 2 (TRAF3IP2) Results in Spontaneous Development of Myocardial Hypertrophy, Fibrosis, and Dysfunction. J Biol Chem. 291 (37), 19425-19436 (2016).
- Jara, A., et al. Cardiac-Specific Disruption of GH Receptor Alters Glucose Homeostasis While Maintaining Normal Cardiac Performance in Adult Male Mice. Endocrinology. 157 (5), 1929-1941 (2016).
- Kerr, B. A., et al. Stability and function of adult vasculature is sustained by Akt/Jagged1 signalling axis in endothelium. Nat Commun. 7, 10960 (2016).
- Wagner, N., et al. Coronary vessel development requires activation of the TrkB neurotrophin receptor by the Wilms’ tumor transcription factor Wt1. Genes Dev. 19 (21), 2631-2642 (2005).
- Wagner, K. D., et al. The Wilms’ tumour suppressor Wt1 is a major regulator of tumour angiogenesis and progression. Nat Commun. 5, 5852 (2014).
- Yang, X. P., et al. Echocardiographic assessment of cardiac function in conscious and anesthetized mice. Am J Physiol. 277 (5 Pt 2), H1967-H1974 (1999).
- Rottman, J. N., et al. Temporal changes in ventricular function assessed echocardiographically in conscious and anesthetized mice. J Am Soc Echocardiogr. 16 (11), 1150-1157 (2003).
- Quiñones, M. A., et al. Recommendations for quantification of Doppler echocardiography: a report from the Doppler Quantification Task Force of the Nomenclature and Standards Committee of the American Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 15 (2), 167-184 (2002).
- van Laake, L. W., et al. Monitoring of cell therapy and assessment of cardiac function using magnetic resonance imaging in a mouse model of myocardial infarction. Nat Protoc. 2 (10), 2551-2567 (2007).
- Wagner, K. D., et al. The Wilms’ tumor suppressor Wt1 is expressed in the coronary vasculature after myocardial infarction. FASEB J. 16 (9), 1117-1119 (2002).
- Wagner, K. D., et al. RNA induction and inheritance of epigenetic cardiac hypertrophy in the mouse. Dev Cell. 14 (6), 962-969 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol. 23 (4), 291-299 (2001).
- Lazzeroni, D., Rimoldi, O., Camici, P. G. From Left Ventricular Hypertrophy to Dysfunction and Failure. Circ J. 80 (3), 555-564 (2016).
- Ismail, J. A., et al. Immunohistologic labeling of murine endothelium. Cardiovasc Pathol. 12 (2), 82-90 (2003).
- Benton, R. L., Maddie, M. A., Minnillo, D. R., Hagg, T., Whittemore, S. R. Griffonia simplicifolia isolectin B4 identifies a specific subpopulation of angiogenic blood vessels following contusive spinal cord injury in the adult mouse. J Comp Neurol. 507 (1), 1031-1052 (2008).
- Ayoub, A. E., Salm, A. K. Increased morphological diversity of microglia in the activated hypothalamic supraoptic nucleus. J Neurosci. 23 (21), 7759-7766 (2003).
- Maddox, D. E., Shibata, S., Goldstein, I. J. Stimulated macrophages express a new glycoprotein receptor reactive with Griffonia simplicifolia I-B4 isolectin. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1), 166-170 (1982).
- dela Paz, N. G., D’Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell Tissue Res. 335 (1), 5-16 (2009).
