ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש
Summary
שמירה על כיסוי מחסום דם מוחי היא המפתח להומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקות חוץ גופית כדי לתמצת את התהליכים הבסיסיים הפתולוגיים כי לווסת דם מוח המכשול הכיסוי.
Abstract
מחסום דם מוחי (BBB) מכסה תפקיד מרכזי בהומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית (CNS). BBB מתוחזק באופן דינמי על ידי האסטרוציטים, pericytes ותאי האנדותל במוח (BECs). כאן, אנו מפרטים שיטות להעריך כיסוי BBB באמצעות תרבויות יחיד של BECs האדם הנציח, תרבויות יחיד של BECs העכבר הראשי, ואת מודל התרבות משולש אנושית (BECs, astrocytes ו pericytes) של BBB. כדי להדגיש את הישימות של מבחני למדינות מחלה, אנו מתארים את ההשפעה של olylomeric amyloid-β (oAβ), שהוא תורם חשוב להתפתחות אלצהיימר (AD) התקדמות, על כיסוי BBB. יתר על כן, אנו מנצלים את גורם הצמיחה באפידרמיס (EGF) כדי להאיר את פוטנציאל ההקרנה של התרופה של הטכניקות. התוצאות שלנו מראים כי BECs מתורבת יחיד יחיד משולש ליצור מבנים דמויי רשת כמו בתנאים הבסיסיים, וכי oAβ משבש את זה מבנה התא meshwork ו degenerates מבני רשת preformed,אבל EGF חוסם את ההפרעה הזאת. לכן, הטכניקות המתוארות חשובות לנתח תהליכים בסיסיים וחולי רלוונטיים המווסתים את כיסוי ה- BBB.
Introduction
מחסום דם מוח (BBB) של נימים מוחיים הוא הממשק הגדול ביותר של מגע בין דם למוח וממלא תפקיד מרכזי בהומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית (CNS) 1 , 2 . תהליכים דינמיים ב- BBB מונעים את ספיגה של מולקולות לא רצויות מהדם, מסירים את מוצרי הפסולת מה- CNS, מספקים חומרים מזינים חיוניים ומולקולות איתות ל- CNS, ומווסתים את הנוירו-דלקתיות 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . נזקי BBB נפוצים במהלך ההזדקנות וכמה הפרעות ניווניות כולל מחלת אלצהיימר (AD), טרשת נפוצה ושבץ 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,התחת = "xref"> 6. לכן, תפקוד לקוי של BBB עשוי למלא תפקיד מפתח בהפרעות נוירודגנרטיביות, כולל כמטרה טיפולית.
שמירה על כיסוי כלי חשוב עבור פונקציות homeostatic של BBB. עם זאת, in vivo ו במבחנה נתונים הסכסוך על אם התהליכים המעורבים הפרעות נוירודגנרטיב לגרום כיסוי BBB גבוה או נמוך יותר 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , במיוחד לספירה. לכן, יש רציונל חזק לפיתוח של מודלים במבחנה באמצעות סוגי תאים רלוונטיים כדי להעריך באופן מקיף יותר להבין את הדינמיקה של כיסוי BBB. נימים מוחיים מורכבים אסטרוציטים, pericytes ותאי האנדותל במוח (BECs) <sUp class = "xref"> 3. כל סוגי התאים לתרום את הפונקציה של BBB באמצעות תמיכה מבנית ועל ידי הפרשת המולקולות מפעיל כגון גורמי גדילה אנגיוגניים, ציטוקינים chemokines הפועלים באופרה paracrine ו אוטוקרינית. עם זאת, התאים העיקריים אפקטור של BBB הם BECs 3 . באופן כללי, טכניקות תא התרבות להערכת פונקציה BBB הן מבחני חדירות המבוצעת על תאים הגדלים על מסננים מוסיף, או הערכת רמות של חלבונים BEC מפתח, הן לאחר תוספת של לחצים 14 , 15 , 16 . למרות חשוב, מבחני אלה אינם מתמקדים כיסוי המוח.
הנה, השיטות הקודמות שלנו 17 מפורטים כדי להעריך כיסוי BEC ומבנים דמויי רשת כמו באמצעות תרבויות יחיד של BECs האדם הנציח, תרבויות יחיד של BECs העכבר הראשי, תרבות משולשת אנושית(BECs, astrocytes ו pericytes) של BBB. המטרה היתה להדגים את ההשפעה המזיקה של OAβ, הנחשב תורם חשוב להתקדמות AD, על כיסוי BEC. האפקט המגן של גורם הצמיחה באפידרמיס (EGF) מדגיש את הפוטנציאל של הטכניקה ככלי סינון טיפולי. טכניקה זו כוללת מספר יישומים נרחבים למחקר בסיסי ויישומי, כולל:) 1 הגדרת תפקידם של מסלולים ספציפיים באנגיוגנזה וכיסוי כלי שיט,) 2 הערכת ההשפעות של מחלות וגורמים רלוונטיים להזדקנות על אנגיוגנזה ועל כיסוי כלי, 3) זיהוי תרופתי מטרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות המתוארות ניתן להשתמש כדי לענות על כמה שאלות ביולוגיות היסוד סביב כיסוי המוחי 24 . באופן ספציפי, הם יכולים לזהות אילו קולטנים מסלולי איתות לשחק תפקיד אנגיוגנזה, כיסוי כלי הדם ברקמת סרטן, ותאי האנדותל היקפיים הרלוונטיים למוח. הדוגמאות כוללות קולטני ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ליאון טאי ממומן על ידי אוניברסיטת אילינוי שיקגו start-up קרנות.
Materials
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
Riferimenti
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer’s disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer’s disease. PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer’s-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer’s disease, but not in Binswanger’s disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer’s disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer’s Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
