血液脳関門メッシュ様血管形成および崩壊を評価するためのインビトロアッセイ
Summary
血液脳関門のカバレッジを維持することは、中枢神経系の恒常性にとって重要である。このプロトコルは、血液脳関門のカバレッジを調節する基本的および病理学的プロセスを描写するためのインビトロ技術を記載する 。
Abstract
血液脳関門（BBB）の適用範囲は、中枢神経系（CNS）の恒常性において中心的な役割を果たす。 BBBは、星状細胞、周皮細胞および脳内皮細胞（BEC）によって動的に維持される。ここでは、不死化ヒトBECの単一培養、初代マウスBECの単一培養、およびBBBのヒト化三重培養モデル（BEC、星状細胞および周皮細胞）を使用して、BBBカバレッジを評価する方法を詳述する。疾患状態に対するアッセイの適用性を強調するために、我々は、BBB適用範囲におけるアルツハイマー病（AD）進行の重要な要因であるオリゴマーアミロイドβ（oAβ）の効果を記載する。さらに、本発明者らは、この技術の薬物スクリーニング能力を明らかにするために、上皮増殖因子（EGF）を利用する。本発明者らの結果は、単一および三重培養BECが基底条件下で網目様構造を形成し、oAβがこの細胞網形成を破壊し、予備形成された網構造を変性させ、EGFはこの中断を阻止します。したがって、記載された技術は、BBBカバレッジを調節する基本的かつ疾患関連プロセスを解剖するために重要である。
Introduction
脳毛細血管の血液脳関門（BBB）は、血液と脳の接触の最大の界面であり、中枢神経系（CNS） 1,2の恒常性において中心的な役割を果たす。 BBBでのダイナミックなプロセスは、血液からの不要な分子の取り込みを防ぎ、中枢神経系からの老廃物を除去し、必須の栄養素とシグナル伝達分子をCNSに供給し、神経炎症を調節する1,2,3,4,5。 BBB損傷は、加齢およびアルツハイマー病（AD）、多発性硬化症および脳卒中1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 、ass = "xref"> 6。したがって、BBB機能不全は、治療標的を含む神経変性疾患において重要な役割を果たす可能性がある。
船舶のカバレッジを維持することは、BBBの恒常性機能にとって重要である。しかし、 インビボおよびインビトロでのデータ衝突は、神経変性疾患に関与するプロセスが、特にADにおいて、BBB適用範囲を6,7,8,9,10,11,12,13より高くまたは低くするかどうかについて競合する。したがって、BBBカバレッジのダイナミクスを評価し、より包括的に理解するために、関連する細胞タイプを使用したインビトロモデルの開発には強い根拠があります。脳毛細血管は、星状細胞、周皮細胞および脳内皮細胞（BEC）から構成され、 <sup class = "xref"> 3。全ての細胞型は、構造支持体を介して、パラクリンおよびオートクリン様様式で作用する血管新生増殖因子、サイトカインおよびケモカインなどのエフェクター分子の分泌を介して、BBBの機能に寄与する。しかし、BBBの主要エフェクター細胞はBECである3 。一般に、BBB機能を評価するための細胞培養技術は、ストレッサー14,15,16の添加後の両方において、フィルターインサート上で増殖させた細胞、または重要なBECタンパク質のレベルを評価する浸透性アッセイである。重要ではあるが、これらのアッセイは脳血管カバレッジに焦点を当てていない。
ここで、我々の以前の方法17は、不死化ヒトBECの単一培養、初代マウスBECの単一培養、およびヒト化三重培養を使用して、BEC適用範囲および網状様構造を評価するために詳述されているBBBのモデル（BEC、星状細胞および周皮細胞）を同定した。目標は、AECがAD進展の重要な要因であると考えられている有害作用がBECの対象範囲に及ぼす影響を実証することでした。表皮成長因子（EGF）の保護効果は、治療スクリーニングツールとしてのこの技術の可能性を強調している。この技術は、1）血管新生および血管カバレッジにおける特定の経路の役割の描写、2）血管新生および血管カバレージに対する疾患および加齢関連因子の影響の評価、および3）薬理学的目標。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載された方法は、脳血管カバレッジを取り巻くいくつかの基本的な生物学的問題に対処するために利用することができる24 。具体的には、どの受容体およびシグナル伝達経路が、血管新生、癌組織における血管カバレッジ、および脳に関連する末梢内皮細胞において役割を果たすかを同定することができる。例としては、血管新生増殖因子受容体、酸化窒素、マイトジェ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
レオン・タイは、イリノイ大学シカゴの創業資金によって資金提供を受けています。
Materials
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
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