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Articolo metodologico

In vitro dosaggi per valutare la formazione e la rottura del vaso come la barriera emato-cerebrale

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DOI:

10.3791/55846

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20 giugno 2017

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Illinois at Chicago

In questo articolo

Sommario

Il mantenimento della copertura della barriera emato-sangue è fondamentale per l'omeostasi del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive tecniche in vitro per delineare i processi fondamentali e patologici che modulano la copertura della barriera emato-sangue.

Abstract

La copertura del sangue-cervello (BBB) ​​svolge un ruolo centrale nell'omeostasi del sistema nervoso centrale (CNS). Il BBB è mantenuto dinamicamente da astrociti, periciti e cellule endoteliali cerebrali (BECs). Qui metodi dettagliati per valutare la copertura BBB utilizzando singole colture di BEC umani immortalizzati, singole colture di BEC primari del mouse e un modello di coltura triplicata umanizzata (BECs, astrociti e periciti) del BBB. Per evidenziare l'applicabilità dei dosaggi agli stati di malattia, descriviamo l'effetto dell'amyloid oligomerico (oAβ), che rappresenta un importante contributo alla progressione della malattia di Alzheimer (AD), sulla copertura BBB. Inoltre, utilizziamo il fattore di crescita epidermico (EGF) per illuminare il potenziale di screening delle droghe delle tecniche. I nostri risultati mostrano che singole e triple coltivate BECs formano strutture a maglia in condizioni basali e che oAβ interferisce con questa formazione di mesh e degenerizza le strutture preformate di maglie,Ma EGF blocca questa rottura. Quindi le tecniche descritte sono importanti per la dissezione di processi fondamentali e rilevanti per la malattia che modulano la copertura BBB.

Introduzione

La barriera emato-cerebrale (BBB) ​​dei capillari cerebrali è la più grande interfaccia del contatto ematico-to-cerebrale e svolge un ruolo centrale nell'omeostasi del sistema nervoso centrale (CNS) 1 , 2 . I processi dinamici del BBB impediscono l'assorbimento di molecole indesiderate dal sangue, rimuovono i prodotti di scarto dal CNS, forniscono nutrienti essenziali e molecole di segnalazione al CNS e modulano la neuroinflammazione 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Il danno di BBB è prevalente durante l'invecchiamento e diversi disturbi neurodegenerativi tra cui la malattia di Alzheimer (AD), la sclerosi multipla e l'ictus 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6. Pertanto, la disfunzione di BBB può svolgere un ruolo chiave nei disturbi neurodegenerativi, anche come obiettivo terapeutico.

Il mantenimento della copertura dei recipienti è importante per le funzioni homeostatiche del BBB. Tuttavia, i dati in vivo e in vitro confligano sul fatto che i processi coinvolti nei disturbi neurodegenerativi causino una copertura BBB maggiore o minore 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , particolarmente in AD. Pertanto, vi è una forte logica per lo sviluppo di modelli in vitro utilizzando tipi di cellule per valutare e comprendere in modo più completo le dinamiche della copertura BBB. I capillari cerebrali sono composti da astrociti, periciti e cellule endoteliali cerebrali (BECs) 3. Tutti i tipi di cellule contribuiscono alla funzione del BBB attraverso il supporto strutturale e attraverso la secrezione di molecole effector come fattori di crescita angiogenici, citochine e chemiokine che agiscono in modo paracrino e autocrino. Tuttavia, le principali cellule efficaci del BBB sono BECs 3 . In generale, le tecniche di coltura cellulare per la valutazione della funzione BBB sono i test di permeabilità eseguiti su cellule coltivate su inserti di filtri o valutando i livelli di proteine ​​chiave BEC, sia dopo l'aggiunta di stress 14 , 15 , 16 . Sebbene importanti, questi dosaggi non riguardano la copertura cerebrovascolare.

Qui, i nostri precedenti metodi 17 sono dettagliati per valutare la copertura BEC e le strutture di tipo reticolo utilizzando singole colture di BEC umani immortalizzati, singole colture di BEC primari del mouse e una cultura tripla umanizzataModello (BEC, astrociti e periciti) del BBB. L'obiettivo era dimostrare l'effetto dannoso di oAβ, che è considerato un importante contributore alla progressione dell'AD, sulla copertura BEC. L'effetto protettivo del fattore di crescita epidermico (EGF) evidenzia il potenziale della tecnica come strumento di screening terapeutico. La tecnica presenta diverse applicazioni per la ricerca di base e applicata, tra cui: 1) definire il ruolo di percorsi specifici in materia di angiogenesi e copertura dei vasi, 2) valutare gli effetti delle malattie e dei fattori rilevanti sull'invecchiamento sull'angiogenesi e sulla vasca e 3) individuare le attività farmacologiche obiettivi.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti seguono i protocolli del Comitato di istruzione e tutela degli animali istituzionali dell'Università dell'Illinois, Chicago.

1. Preparazione generale

NOTA: La linea cerebrale endoteliale (hCMEC / D3) è una linea umana immortalizzata ampiamente caratterizzata dalla linea BEC 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Coltivare le cellule hCMEC / D3 sulle colonie di coltura tissutale rivestite con collagene tipo I (pelle di vitello, diluizione 1:20 di soluzione 0,1% in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) contenente Ca 2+ e Mg 2+ ) nel basale Endothelial Growth Basal Medium (EBM-2) contenente 2-5% di siero fetale fetale (FBS), 10% acido ascorbico, 10% gentamicina solfato, 25% idrocortisone e 1/4 del volume totale degli integratori fattori di crescita forniti per 500 mL di supporti [ Vascolare endotelio gr(IGF-1) e fattore di crescita fibroblastica basale umano (bFGF), vedi tabella dei materiali ]. Il fattore di crescita (VEGF), il fattore di crescita epidermico (EGF)
NOTA: il medium EBM-2 con FBS ei fattori di crescita è indicato come "EBM-2 complete". EBM-2 senza FBS e integratori viene chiamato "EBM-2 basal". A piena confluenza, le cellule hCMEC / D3 sono ~ 1 x 10 5 cellule / cm 2 .

  1. Passaggio delle cellule hCMEC / D3 in un rapporto di 1: 5 prima incubando con HBSS per 3 min senza Ca 2+ e Mg 2+ seguito dal distacco con 5 mL di trysina / EDTA (0,25%) per 5 min. Neutralizzare la tripsina usando EBM-2 completa (neutralizzazione 1: 1) e centrifugare a 290 xg per 5 minuti a 4 ° C; Scartare il surnatante. Riposizionare il pellet in EBM-2 completo e ri-piastra a rapporto 1: 5.
  2. Coltivare le pericie umane primarie e gli astrociti secondo il protocollo del fornitore [ Tabella dei Materiali ]. culturE le pericelle nel mezzo basico perlicente con supplemento di crescita FBS e pericita.
  3. Coltivare gli astrociti umani nel terreno astrocitico contenente fattori di crescita astrocitico. Coltivare sia le pericie che gli astrociti in flaconi di coltura tissutale rivestiti con 3 ml di poli-L-lisina (PLL) per l'adesione cellulare e utilizzare le cellule tra i passaggi 2 e 5.
  4. Eutanizzare 7 topi e rimuovere gli steli del cervello e la cerebella con le pinze; Staccare i meningi con un accurato spostamento dei cervelli sulla garza. Tritare il tessuto cerebrale rimanente in un piatto di Petri in Medium Minimal Essential (MEM) con HEPES (5 mL per cervello) con una lama di rasoio sterile. Isolare i topi primari del BEC da topi di 2 mesi C57BL / 6J secondo il protocollo di riferimento 20 .
  5. Trasferire il tessuto cerebrale macinato in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare a 290 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e incubare il tessuto in un papain (833,33 μL per cervello) e DNase (41,7 μL per cervello)Soluzione, in un bagno d'acqua di 37 ° C per 1 ora, per digerire il tessuto.
  6. Tritare l'omogenato in sequenza con aghi da 19 e 21, mescolare con un rapporto 1: 1 con una soluzione al 22% di Bovine Serum Albumin (BSA) e centrifugare a 1360 xg per 10 minuti a 4 ° C.
  7. Resuspendere il pellet risultante in 1 mL di EBM-2 e centrifugare a 290 xg per 5 minuti a 4 ° C. Riposizionare nuovamente in 1 mL di EBM-2 completare e piastrare le cellule (1 mL / pozzetto) su piastre a 6 pozzetti rivestite con collagene (~ 1 cervello per pozzetto).
  8. Sostituire il supporto 24 h più tardi con EBM-2 completo contenente 4 μg / mL puromicina cloridrato; Sostituire con EBM-2 completo dopo 2 giorni. I BEC primari sono coltivati ​​come per le cellule hCMEC / D3 e sono in piena confluenza a 1 x 10 5 cellule / cm 2 .
  9. Preparare 100 μM di oAβ, 24 h prima del dosaggio.
    NOTA: l'oAβ è considerata la forma di malattia di A. Per l'oAβ, utilizzare le preparazioni ben caratterizzate descritte da DahlgreN et al. 21 .
  10. Scongelare la soluzione di base della membrana basale a 4 ° C e trasferire l'aliquota in strisce sterili PCR (8 tubi) a 140 μl di membrana basale per tubo. Riaffilare ogni striscia e conservare a -20 ° C. Sciogliere una striscia a 96 pozzetti a 4 ° C, 24 h prima del dosaggio. Pre-raffreddare le punte della pipetta per evitare la solidificazione.
    NOTA: Tutto il trattamento della matrice della membrana basale deve essere effettuato su ghiaccio per evitare una rapida solidificazione. Poiché 10 μL per pozzetto di membrana basale viene utilizzato il giorno del dosaggio, ogni striscia è sufficiente per una piastra a 96 pozzetti.
  11. Incubare completamente confluenti BEC in EBM-2 basale, 24 h prima del dosaggio.
    NOTA: La motivazione è: EBM-2 completo contiene fattori integrati e FBS allo scopo di promuovere la crescita cellulare ottimale; Tuttavia, gli stessi percorsi molecolari che promuovono la crescita cellulare sono importanti anche per la copertura e la dinamica delle cellule endoteliali del cervello, sia in presenza che in abseNce di uno stressore. Noi quindi il siero e il supplemento affamano i BEC per ridurre l'effetto confondente dell'attivazione residua di percorsi cellulari di segnalazione. Da notare, le cellule sono brevemente (5 min) esposte a FBS durante la neutralizzazione delle cellule trypsinizzate prima del dosaggio. In contrasto con i BEC, le pericie e gli astrociti non sono affamati dal siero, a causa del fabbisogno di diversi fattori di crescita e della relativa instabilità di questi tipi di cellule in risposta alla fame di siero (laboratorio Tai, osservazioni inedite).
    NOTA: il basale EBM-2 è utilizzato durante il saggio per la formazione di singoli e triplici colture a maglia e le prove di interruzione. Questo è fondamentale per prevenire la confusione di stress o di trattamento che dipendono dal segnale.

2. Analisi di formattazione e di rottura di maglia

  1. Saggi di coltura singola BEC:
    NOTA: tre diversi paradigmi per le singole culture di BEC sono mostrati in Figura 1A . Ogni paradigma è stato progettato per valutare la risposta dei BEC in diversi modelli di copertura delle vasche. Il paradigma 1 è la formazione di meshwork. Questo paradigma è stato progettato per esaminare gli effetti di stress e / o trattamenti su angiogenesi e formazione di meshwork. BECs, oAβ e trattamenti sono tutti aggiunti alla piastra al punto 0 h. Il paradigma 2 è la prevenzione della rottura del lavoro di rete. Le cellule vengono placcate in presenza di un fattore di crescita o di un farmaco e incubate per 4 ore per formare strutture simili a maglie reticolate. Uno stressor, oAβ in questo caso, viene aggiunto dopo 4 h. Questo paradigma valuta la capacità di un trattamento per prevenire danni causati da stress causati da strutture preformate. Il paradigma 3 è il trattamento simultaneo della rottura del meshwork. Le cellule sono placcate e consentite di formare strutture di tipo reticolo per 4 ore. I trattamenti e l'oAβ vengono poi aggiunti contemporaneamente al punto di 4 h, valutando la capacità della rete cellulare preformata di rispondere a vari trattamenti. Tutti i paradigmi perSimili passi comuni, ad eccezione delle differenze nel tempo di aggiunta del trattamento.
    1. Al giorno del dosaggio, pipettare la matrice della membrana basale a 10 μL / pozzetto nel fondo delle piastre a 96 pozzetti e lasciare impostare per 1 ora a 37 ° C.
    2. Sospendere il colorante liofilizzato di monitoraggio delle cellule verdi (vedere tabella dei materiali ) in 10 μL di DMSO per generare una soluzione di 10 mM stock e diluire a 10 μM (1: 1000) nel basale EBM-2. Rimuovere i supporti dal pallone completamente confluente e sostituirlo con basalto EBM-2 contenente il colorante verde di monitoraggio delle cellule (5 mL per un pallone da 75 cm 2 ). Preloadere BECs con il colorante verde di rilevamento delle cellule, 20 minuti prima dell'inizio del dosaggio.
    3. Incubare le cellule per 20-30 minuti a 37 ° C, rimuovere il mezzo con il colorante di monitoraggio delle cellule e staccare le cellule come descritto nel punto 1.1. Neutralizzare i supporti con EBM-2 contenente il 10% di FBS e centrifugare a 240 xg per 5 minuti a 4 ° C. Resuspendere il pellet in 1 mL di basale EBM-2.
    4. Piattare i BEC nella piastra a 96 pozzetti a 10.000 cellule / pozzetto nel basale EBM-2 (punto 0 h in tutti i paradigmi).
      NOTA: A seconda del paradigma utilizzato, i trattamenti, gli stress oi controlli del veicolo vengono aggiunti nei punti di tempo specificati. In tutti i paradigmi, il mezzo viene raccolto per l'analisi successiva ( es. Analisi ELISA) e le cellule vengono fissate a 24 h con paraformaldehide appena preparato al 4% in fosforo bufferato (PBS). Come approccio alternativo per determinare gli effetti di termine di oAβ sulla formazione di maglie, il protocollo potrebbe essere modificato per pre-incubare le fiasche di coltura confluente con oAβ e quindi eseguire i paradigmi di formazione di maglie (+/- oAβ).
      NOTA: Il volume finale in ogni pozzetto per tutti i paradigmi è 70 μL. Tutti i trattamenti (oAβ, EGF, ecc. ) Vengono aggiunti ai loro rispettivi pozzetti ad una diluizione 1:20, ovvero 3,5 μL per trattamento. Per il paradigma 1, le cellule vengono aggiunte in una soluzione di sospensione cellulare a 63 μL / well. Adesso vengono aggiunti oAβ, trattamenti e controlli desiderati a 3,5 μL / pozzetto ciascuno, dando un totale di 70 μL. Per il paradigma 2 vengono aggiunti 63 μL di sospensione cellulare e 3,5 μL di trattamento ( es. 100 ng / ml di EGF) al punto 0 h. Dopo 4 ore di incubazione, si aggiunge 3,5 μL di uno stock oAβ (per esempio per 100 nM di concentrazione finale oAβ, 3,5 μL di 2 μM di stock oAβ). Per il paradigma 3 si aggiunge 63 μL di sospensione cellulare al punto 0 h e a 4 h, oAβ e si aggiungono i trattamenti desiderati a 3,5 μL / pozzetto ciascuno, dando un totale di 70 μL. Questi volumi possono essere regolati secondo i trattamenti. Ad esempio, se è richiesto un solo trattamento, il volume della sospensione cellulare può essere regolato a 66,5 μL (mantenendo 10.000 cellule / pozzetto) e il volume di trattamento può rimanere a 3,5 μL.
  2. Saggio di cultura tripla:
    NOTA: Oltre ai test di coltura singola di BEC, abbiamo sviluppato( Figura 1B ) per determinare la risposta di BECs, periciti e astrociti all'interno di reti preformate a fattori di pertinenza rilevanti ( es. OAβ). I BEC vengono placcati in presenza di trattamenti desiderati a 0 h. A 4 h, periciti vengono aggiunti dolcemente alla lastra. A 7 h, gli astrociti vengono aggiunti alla piastra, seguita dall'aggiunta di uno stressore a 11 h. Le cellule vengono quindi incubate fino al punto di 24 ore.
    NOTA: Per i saggi di cultura tripla, è importante considerare i tempi per garantire che tutte le cellule siano confluenti allo stesso tempo. Gli astrociti umani e le pericelle devono essere coltivate 1 settimana prima del dosaggio, mentre le cellule hCMEC / D3 devono essere placcate o passate 4-5 giorni prima della data del dosaggio. Inoltre, è importante utilizzare celle primarie a basso passaggio (2-5) per evitare deriva fenotipica.
    1. Aggiungere la soluzione di lavoro per la tintura della cella a verde alle cellule hCMEC / D3 20 minuti prima di iniziare il test. Piattare le cellule hCMEC / D3 a 10, 000 cellule / pozzetto in EBM-2 basale (0 ora di ora). I volumi usati sono 45 μL di sospensione cellulare e 3,5 μL di trattamento ( cioè concentrazioni di EGF finali di 50 ng / ml, 100 ng / ml, o 1000 ng / ml da scorte che sono 20 volte più concentrate).
    2. Dopo l'incubazione a 37 ° C di 3,5 h, aggiungere alla pericia primaria umana la soluzione di lavoro per la tintura dei cavi blu (azoto blu di 10 μM nel basale EBM-2). Al punto di tempo di 4 h (~ 30 min di incubazione con il colorante di monitoraggio delle cellule) aggiungere delicatamente 2'000 periciti / pozzetto alla piastra contenente hCMEC / D3 in un volume di 6 μL / pozzetto.
    3. Dopo un'ulteriore 2,5 ore di incubazione (totale 6,5 h da 0 ora di ora), aggiungere gli astrociti primari umani alla soluzione di lavoro per la tintura della cellula arancione (10 μM tracker cellulare arancione in basale EBM-2). Al punto di 7 h aggiungete delicatamente 10.000 astrociti / pozzetto alla lastra in 12 μL di volume. Pertanto, il rapporto cellulare complessivo per le cellule endoteliali: periciti: astrociti iS 5: 1: 5. Inoltre, il volume raggiunto a questo punto è di 66,5 μL.
    4. Aggiungere oAβ (3,5 μL di stock di 100 μM) 4 h più tardi (11 ore totali da 0 ora).
    5. Fissare le cellule 13 h più tardi in paraformaldeide al 4% in PBS.
      Attenzione: indossare indumenti protettivi, guanti e occhiali durante la manipolazione di paraformaldeide.

3. Quantificazione

  1. Cattura immagini di fluorescenza dell'intero pozzetto della piastra a 96 pozzetti ad ingrandimento 1,6X con un tempo di esposizione a 2 s al 50% di potenza massima utilizzando un microscopio di dissezione.
    NOTA: possono essere utilizzati microscopi equivalenti; Tuttavia, è fondamentale catturare l'intero pozzo per un'analisi completa.
  2. Per l'analisi quantitativa, elaborare le immagini usando il plugin 22 dell'analizzatore di angiogenesis ImageJ per quantificare il numero di rami, il numero di maglie e la lunghezza totale della cella (questi letture vengono automaticamente tabulati dalla softwaRi) come descritto di seguito. Un protocollo visivo dettagliato di questo passaggio è fornito in Figura 2 .
    1. Apri fiji ImageJ cliccando sull'icona del software.
    2. Clicca sulle doppie frecce rosse in avanti alla fine della barra degli strumenti, quindi fai clic su "Angiogenesis Analyzer".
    3. Seleziona la cartella con i file di immagine, fai clic su "Apri".
    4. Quando viene visualizzata la casella "impostazioni per l'analisi", fare clic su "OK".
    5. Quando viene visualizzata la casella "elaborazione immagini", che indica il numero di immagini da elaborare, fare clic su "OK".
    6. Quando viene visualizzata la casella "finestra di avanzamento batch", che indica il tempo di elaborazione stimato. Durante questo periodo il programma quantifica le uscite tra cui il numero di rami, il numero di maglie e la lunghezza totale della cella.
      NOTA: Una volta che tutte le immagini vengono quantificate, il file dei risultati verrà visualizzato nella cartella dell'immagine originale come un documento di foglio di calcolo.
    7. SelezionareIl foglio di foglio di calcolo che contiene i risultati e confronta il numero di rami, maglie e lunghezza totale delle celle tra i gruppi.
      NOTA: Nel saggio di coltura triplo ImageJ viene ulteriormente utilizzato per analizzare la copertura e il numero di pericite / astrociti. Le immagini sono soggette a un esperimento acustico e la funzione "analisi delle particelle" utilizzata per generare letture. Le cellule fisse e le strutture tubolari possono anche essere immagazzinate per Aβ 17 o altri marcatori.

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Risultati

In singole colture, entrambe le cellule hCMEC / D3 ( Figura 3A ) e il BEC primario del mouse ( Figura 3B ) formano strutture a maglie simili a tutto il pozzo. Le strutture sono caratterizzate da un reticolo di nodi interconnessi ( Figura 3 ). In tutti i paradigmi descritti ( Figura 1 ), le strutture simili a maglie reticolari sono simili dopo 24 ore nei gruppi di contro...

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Discussione

I metodi descritti possono essere utilizzati per affrontare diverse questioni biologiche fondamentali che riguardano la copertura cerebrovascolare24. In particolare, essi possono identificare quali recettori e vie di segnalazione svolgono un ruolo in angiogenesi, la copertura dei recipienti nei tessuti del cancro e cellule endoteliali periferiche rilevanti per il cervello. Gli esempi includono i recettori del fattore di crescita angiogenico, l'ossido nitrico, la mitogen attivata dalla proteina chinasi e la segnalazi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

Leon Tai è finanziato da fondi d'avvio di Chicago University of Illinois.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cellule hCMEC/D3MiliporeSCC066
EBM-2 terreno basaleLonzaCC-3156
Collagene di tipo 1ThermoFisherA1064401
HBSS, calcio, magnesio, senza rosso fenoloThermoFisher14025092
HBSS, senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenoloThermoFisher14175095
Tripsina-EDTA (0,25%)ThermoFisher25200056
Concentrazioni finali degli integratori di fattori di crescita SingleQuot per terreni EBM2LonzaCC-4147
5% FBSLonzaCC-4147
10% Acido ascorbicoLonzaCC-4147
10% Gentamicina solfatoLonzaCC-4147
25% IdrocortisoneLonzaCC-4147
1/4 del volume dei fattori di crescita forniti: fattore di crescita dei fibroblasti, fattore di crescita epidermico, fattore di crescita insulino-simile, fattore di crescita dell'endotelio vascolareLonzaCC-4147
Puromicina cloridratoVWR80503-312
MEM-HEPESThermo Scientific12360-038
Sistema di dissociazione cellulare della papaina (papaina e DNase1)Worthington BiochemicalLK003150
Periciti umaniSciencell1200
Pericyte basal mediaSciencell1201
Integratore per la crescita dei pericitiSciencell1252
Astrocytes umaniSciencell1800
Astrocyte mediaSciencell1801
Astrocyte integratore per la crescitaSciencell1852
Membrana basale (Matrigel Growth Factor Reduced)Corning356231
Angiogenesi m-plates (96 pozzetti)ibidi89646
Fattore di crescita epidermico umanoShenendoah Biotechnology100-26
CellTracker verdeThermoFisherC7025
CellTracker arancioneThermoFisherC34551
CellTracker bluThermoFisherC2110
Poli-l-lisinaSciencell0403
10% Formalina tamponata neutraSigma-AldrichHT5012-60ML
C57BL topiJackson Laboratoryna
PCR tube stripsGeneMateT-3014-2
Zeiss stereo discover v.8 microscopio da dissezioneZeissna

Riferimenti

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