Den omvendte hjertemodel for interstitiell transudatsamling fra det isolerede rottehjerte
Summary
Denne protokol beskriver en metode til at indsamle hjerteinterstitielvæske fra det isolerede, perfuserede rottehjerte. For fysisk at adskille interstitialtransudat fra koronar venøs effluentperfusus, er Langendorff-perfusionshjertet omvendt, og transudatet (interstitialvæsken) dannet på hjerteoverfladen opsamles under anvendelse af en blød latexhætte.
Abstract
Den foreliggende protokol beskriver en unik fremgangsmåde, der muliggør opsamling af hjerte-transudat (CT) fra det isolerede, saltvandsprimerede rottehjerte. Efter isolering og retrograd perfusion af hjertet i overensstemmelse med Langendorff teknik, er hjertet omvendt til en opad og nedad position og stabiliseres mekanisk af et ballonkateter indsat i venstre ventrikel. Derefter placeres en tynd latexdæksel – som tidligere er kastet til at matche den gennemsnitlige størrelse af rottehjerte – over epikardialoverfladen. Udløbet af latexdækslet er forbundet med siliciumrør, med den distale åbning 10 cm under basisniveauet af hjertet, hvilket giver en lille sugning. CT produceret kontinuerligt på epikardialoverfladen opsamles i isafkølede hætteglas til yderligere analyse. CT-dannelsens hastighed varierede fra 17 til 147 μl / min (n = 14) i kontrol- og infarcted-hjerter, hvilket repræsenterer 0,1-1% af det koronære venøse effluentperfusat. Proteomisk analyse og høj perfoRmance væskekromatografi (HPLC) viste, at den opsamlede CT indeholder et bredt spektrum af proteiner og purinergiske metabolitter.
Introduction
Hjertesvigt (HF) er den største dødsårsag hos mennesker verden over 1 . HF forekommer ofte på grund af myocarditis, iskæmisk fornærmelse over for myokardiet og omlægning af venstre ventrikel, hvilket fører til den progressive forringelse af den kardiale kontraktile funktion og patienternes livskvalitet. Selvom fremskridt inden for kardiologi og hjerteoperation har bemærkelsesværdigt sænket HF-dødelighed, tjener de kun som forbigående "forsinkelser" af en uundgåeligt progressiv sygdomsproces, som bærer signifikant morbiditet. Derfor understreger den nuværende mangel på effektiv behandling behovet for at identificere nye molekylære mål, der kan forhindre eller endda reversere HF. Dette indbefatter ændringer i den ekstracellulære matrix, ukontrolleret hjerteimmunrespons og interaktioner mellem hjerte- og ikke-hjerteceller 2 .
Det er vigtigt at erkende, at mikromiljøet, at hjerteceller udsættes for direcTly former immunforsvaret og regenerativ respons af det skadede hjerte. I det isolerede, saltvandsprimerede hjerte frembringes CT på hjerteoverfladen i form af små dråber, der er afledt af det interstitielle fluidumrum ( dvs. mikromiljø), både under fysiologiske og patofysiologiske betingelser 3 , 4 , 5 . Derfor kan analyse af CT ( dvs. interstitiel væske) hjælpe med at identificere faktorer, der regulerer hjerte metabolisme og kontraktil funktion 6 eller påvirker immuncellefunktioner efter migrering i det skadede hjerte. Potentielt kan dette føre til udvikling af nye terapeutiske strategier til behandling af HF.
Samlingen af CT fra murine hjerter er teknisk udfordrende. I regelmæssige Langendorff-perfuserede hjerter er den eksklusive samling af CT vanskelig fordi blandingen af CT med coronarY venøs spildevand perfusat fortynder uforudsigeligt enhver koncentration af metabolitter / enzymer frigivet fra det interstitielle rum. En mulig strategi til at overvinde denne begrænsning er at udelukke det venøse udløb ved at cannulere pulmonale og samtidigt ligere lungearven 7 . Denne fremgangsmåde står imidlertid over for vanskeligheder forbundet med cannulationen og ligeringen af lungearterien og venen, hvilket forårsager potentiel lækage af venøst udløb i hjertetransudatet. Konceptet med at anvende en modersmålemodel blev først introduceret af gruppen Kammermeier, der omvendte det isolerede, perfuserede hjerte til en opadrettet position og anbragte en tynd latexhætte på epikardialoverfladen for kontinuerligt at prøve CT uden forurening af venøst spildevand 8 , 9 . Ved anvendelse af denne procedure blev CT vist at tilvejebringe en meget følsom foranstaltning af metabolitterne frigivet fra hjertet 9 ,Kapillær overførsel af fedtsyrer 8 og virale partikler 10 .
For nylig har parakriske faktorer, der kan regulere det lokale immunrespons og øge hjerteangiogenese 11, været impliceret i den fordelagtige virkning af stamcellebaseret terapi for hjertesygdom. Analysen af CT i det omvendte hjerte kan bidrage til kemisk identifikation af disse individuelle parakrine faktorer. Derudover kan CT hjælpe med at identificere faktorer involveret i in vivo aktivering af immunceller i hjertet.
Den detaljerede beskrivelse af CT-samling fra hjerteoverfladen, der tilvejebringes her, er eksperimentelt nyttig for forskere, der studerer interaktionen mellem immunceller, fibroblaster, endotelceller og kardiomyocytter i forhold til den overordnede hjertefunktion. Som nævnt ovenfor bærer interstitialvæsken informationen til celle-til-celle kommunikation i hjertet, whDet kan bekvemt bedømmes ved indsamling af CT. Den detaljerede tekniske beskrivelse, herunder en videoprotokol om hvordan man samler CT fra det omvendte hjerte, skal lette den fremtidige anvendelse af denne unikke teknik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den omvendte hjertemodel er baseret på den veletablerede Langendorff-hjertep perfusionsteknik 12 og udføres ved simpelthen at vende hjerte ind i en opad og nedad position og holde denne position ved hjælp af et stift intra-ventrikulært ballonkateter. På en sådan måde kan hjerteinterstitialtransudat separeres fysisk fra koronar venøs effluentperfusat, idet den drypper af tyngdekraft fra hjertet af hjertet 9 . CT'en kan kontinuerligt opsamles ved hjælp af en tyn…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev finansieret af NSFC 81570244, FoKo 23/2013, og SFB 1116 / B01 og af Cardiovascular Research Institute Düsseldorf (CARID).
Materials
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latexla-tz%E2%80%A8 |
| Aluminum Mold | Home made | – | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | – | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | – | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | – | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | – | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | – | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
Riferimenti
- Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. Death in heart failure: a community perspective. Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).
- Limana, F., et al. Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid. J Mol Cell Cardiol. 48 (4), 609-618 (2010).
- Brunner, F. Cardiac tissue endothelin-1 levels under basal, stimulated, and ischemic conditions. J Cardiovasc Pharmacol. 26, S44-S46 (1995).
- de Lannoy, L. M., et al. Renin-angiotensin system components in the interstitial fluid of the isolated perfused rat heart. Local production of angiotensin I. Hypertension. 29 (6), 1240-1251 (1997).
- Strupp, M., Kammermeier, H. Interstitial Lactate And Glucose-Concentrations Of the Isolated-Perfused Rat-Heart before, during And after Anoxia. Pflugers Arch. 423 (3-4), 232-237 (1993).
- Wienen, W., Jungling, E., Kammermeier, H. Enzyme-Release into the Interstitial Space of the Isolated Rat-Heart Induced by Changes in Contractile Performance. Cardiovasc Res. 28 (8), 1292-1298 (1994).
- De Deckere, E. A., Ten Hoor, ., P, A modified Langendorff technique for metabolic investigations. Pflugers Arch. 370 (1), 103-105 (1977).
- Tschubar, F., Rose, H., Kammermeier, H. Fatty acid transfer across the myocardial capillary wall. J Mol Cell Cardiol. 25 (4), 355-366 (1993).
- Wienen, W., Kammermeier, H. Intra- and extracellular markers in interstitial transudate of perfused rat hearts. Am J Physiol. 254 (4 Pt 2), H785-H794 (1988).
- Sasse, A., Ding, Z. P., Wallich, M., Godecke, A., Schrader, J. Vascular transfer of adenovirus is augmented by nitric oxide in the rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (3), H1362-H1368 (2004).
- Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 103 (11), 1204-1219 (2008).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts. J Vis Exp. (101), e52908 (2015).
- Ding, Z., et al. Epicardium-Derived Cells Formed After Myocardial Injury Display Phagocytic Activity Permitting In Vivo Labeling and Tracking. Stem Cells Transl Med. 5 (5), 639-650 (2016).
- Hartwig, S., et al. Secretome profiling of primary human skeletal muscle cells. Biochim Biophys Acta. 1844 (5), 1011-1017 (2014).
- Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation. J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).
- Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts. Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).
- Heller, L. J., Mohrman, D. E. Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).
