نموذج قلب مقلوب لجمع الخلالي الخلالي من القلب المعزول الجرذ
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لجمع السائل الخلالي القلب من معزولة، القلب الفئران بيرفوسد. لفصل جسديا انفصال الخلالي من الشريان التاجي الوريدي بيرفوسيت، يتم قلب قلب بيرفوسد لانجندورفف، ويتم جمع ترانزودات (السائل الخلالي) التي تشكلت على سطح القلب باستخدام غطاء اللاتكس لينة.
Abstract
يصف هذا البروتوكول نهج فريد من نوعه التي تمكن من جمع ترانزودات القلب (كت) من معزولة، المالحة بيرفوسد القلب الفئران. بعد العزلة والنضح إلى الوراء من القلب وفقا لتقنية لانجندورفف، قلب مقلوب إلى موقف رأسا على عقب واستقر ميكانيكيا من قبل القسطرة البالونية إدراجها في البطين الأيسر. ثم، يتم وضع غطاء اللاتكس رقيقة – يلقي سابقا لتتناسب مع متوسط حجم القلب الفئران – على سطح النخابية. يتم توصيل منفذ غطاء اللاتكس إلى أنابيب السيليكون، مع افتتاح القاصي 10 سم تحت مستوى القاعدة من القلب، وخلق شفط طفيف. كت التي تنتج بشكل مستمر على سطح النخابية يتم جمعها في قارورة تبريد الجليد لمزيد من التحليل. تراوحت نسبة تشكيل كت من 17 إلى 147 ميكرولتر / دقيقة (ن = 14) في السيطرة والقلوب احتشاء، والذي يمثل 0.1-1٪ من الشريان التاجي الوريدية بيرفوسيت. تحليل بروتيوميك وعالية بيرفوكشفت كروماتوغرافيا السائل رمانس (هبلك) أن كت التي تم جمعها يحتوي على مجموعة واسعة من البروتينات والأيض بورينرجيك.
Introduction
فشل القلب (هف) هو السبب الرئيسي للوفاة في البشر في جميع أنحاء العالم 1 . هف غالبا ما يحدث بسبب التهاب عضلة القلب، والإهانات الدماغية لعضلة القلب، والبطين الأيسر إعادة عرض، مما يؤدي إلى التدهور التدريجي في وظيفة مقلص القلب ونوعية المرضى من الحياة. وعلى الرغم من أن التقدم في أمراض القلب وجراحة القلب قد أدى إلى انخفاض ملحوظ في معدل الوفيات الناجمة عن فيروس الورم الحليمي البشري، إلا أنها مجرد "مؤخر" مؤقت لعملية مرضية تقدمية لا محالة تحمل مراضة كبيرة. ولذلك، فإن النقص الحالي في العلاج الفعال يؤكد الحاجة إلى تحديد الأهداف الجزيئية الجديدة التي يمكن أن تمنع أو حتى عكس هف. وهذا يشمل التغيرات في المصفوفة خارج الخلية، والاستجابة المناعية القلبي غير المنضبط، والتفاعلات بين الخلايا القلبية وغير القلبية 2 .
من المهم أن ندرك أن المكروية التي تتعرض لخلايا القلب إلى ديريكتيلي الأشكال الاستجابة المناعية والتجدد من القلب المصاب. في القلب المعزول، المالح بيرفوسد، يتم إنشاء كت على سطح القلب في شكل قطرات صغيرة مستمدة من الفضاء السائل الخلالي ( أي المكروية)، سواء في ظل الظروف الفسيولوجية والفيزيائية المرضية 3 ، 4 ، 5 . ولذلك، فإن تحليل كت ( أي السائل الخلالي) قد يساعد على تحديد العوامل التي تنظم الأيض القلبية وظيفة مقلص 6 أو تؤثر على وظائف الخلايا المناعية بعد الهجرة إلى القلب المصاب. يحتمل أن يؤدي ذلك إلى وضع استراتيجيات علاجية جديدة لعلاج هف.
جمع كت من قلوب الفئران هو من الناحية الفنية تحديا. في قلوب لانجندورفف بيرفوسد العادية، ومجموعة حصرية من كت صعبة لأن خليط من كت مع الشريان التاجيy الوريدية السائلة بيرفوسيت يضعف بشكل غير متوقع أي تركيز من الأيضات / الإنزيمات الصادرة عن الفضاء الخلالي. إحدى الاستراتيجيات الممكنة للتغلب على هذا القيد هو استبعاد النفايات السائلة الوريدية عن طريق تحفيز الرئة وفي نفس الوقت ربط الوريد الرئوي 7 . ومع ذلك، فإن هذه الطريقة تواجه صعوبات المرتبطة القنية وربط الشريان الرئوي والوريد، مما تسبب في تسرب محتمل من النفايات السائلة الوريدية في ترانزودات القلب. تم استخدام مفهوم استخدام نموذج القلب العكسي لأول مرة من قبل مجموعة كامرميه التي قلبت قلب بيرفوسد المعزول في وضع رأسا على عقب ووضعت غطاء اللاتكس الرقيق على سطح النخابية لاستمرار عينة كت دون تلوث النفايات السائلة الوريدي 8 ، 9 . باستخدام هذا الإجراء، وقد أظهرت كت لتوفير مقياس حساس جدا من الأيض الصادرة عن القلب 9 ،ونقل الشعرية من الأحماض الدهنية 8 ، والجسيمات الفيروسية 10 .
في الآونة الأخيرة، وقد تورط العوامل باراكرين التي قد تنظم الاستجابة المناعية المحلية وزيادة الأوعية الدموية القلبية 11 في الآثار المفيدة للعلاج القائم على الخلايا الجذعية لأمراض القلب. تحليل كت في قلب عكس قد يساعد على تحديد كيميائيا هذه العوامل باراكرين الفردية. وبالإضافة إلى ذلك، كت قد يساعد على تحديد العوامل التي تنطوي عليها في تنشيط الجسم الحي من الخلايا المناعية في القلب.
الوصف المفصل لجمع كت من سطح القلب، المقدمة هنا، هو مفيد تجريبيا للباحثين دراسة التفاعل بين الخلايا المناعية، الخلايا الليفية، الخلايا البطانية، و كارديوميوسيتس فيما يتعلق وظيفة القلب الشاملة. كما ذكر أعلاه، السائل الخلالي يحمل المعلومات للاتصال خلية إلى خلية داخل القلب، وإش يمكن تقييم مريح من قبل مجموعة من كت. الوصف التقني المفصل، بما في ذلك بروتوكول الفيديو لكيفية جمع كت من قلب عكسها، ينبغي أن يسهل التطبيق المستقبلي لهذه التقنية الفريدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويستند نموذج قلب عكس على راسخة لانجندورفف تقنية نضح القلب 12 ويتم تنفيذها ببساطة عن طريق قلب القلب إلى موقف رأسا على عقب وعقد هذا الموقف باستخدام جامدة البالون داخل البطين القسطرة. في مثل هذه الطريقة، يمكن أن ينفصل القلب ترانزديتات الخلالي جسديا من الشري…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة من قبل نسك 81570244، فوكو 23/2013، و سفب 1116 / B01 ومعهد بحوث القلب والأوعية الدموية دوسلدورف (كاريد).
Materials
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latexla-tz%E2%80%A8 |
| Aluminum Mold | Home made | – | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | – | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | – | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | – | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | – | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | – | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
Riferimenti
- Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. Death in heart failure: a community perspective. Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).
- Limana, F., et al. Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid. J Mol Cell Cardiol. 48 (4), 609-618 (2010).
- Brunner, F. Cardiac tissue endothelin-1 levels under basal, stimulated, and ischemic conditions. J Cardiovasc Pharmacol. 26, S44-S46 (1995).
- de Lannoy, L. M., et al. Renin-angiotensin system components in the interstitial fluid of the isolated perfused rat heart. Local production of angiotensin I. Hypertension. 29 (6), 1240-1251 (1997).
- Strupp, M., Kammermeier, H. Interstitial Lactate And Glucose-Concentrations Of the Isolated-Perfused Rat-Heart before, during And after Anoxia. Pflugers Arch. 423 (3-4), 232-237 (1993).
- Wienen, W., Jungling, E., Kammermeier, H. Enzyme-Release into the Interstitial Space of the Isolated Rat-Heart Induced by Changes in Contractile Performance. Cardiovasc Res. 28 (8), 1292-1298 (1994).
- De Deckere, E. A., Ten Hoor, ., P, A modified Langendorff technique for metabolic investigations. Pflugers Arch. 370 (1), 103-105 (1977).
- Tschubar, F., Rose, H., Kammermeier, H. Fatty acid transfer across the myocardial capillary wall. J Mol Cell Cardiol. 25 (4), 355-366 (1993).
- Wienen, W., Kammermeier, H. Intra- and extracellular markers in interstitial transudate of perfused rat hearts. Am J Physiol. 254 (4 Pt 2), H785-H794 (1988).
- Sasse, A., Ding, Z. P., Wallich, M., Godecke, A., Schrader, J. Vascular transfer of adenovirus is augmented by nitric oxide in the rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (3), H1362-H1368 (2004).
- Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 103 (11), 1204-1219 (2008).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts. J Vis Exp. (101), e52908 (2015).
- Ding, Z., et al. Epicardium-Derived Cells Formed After Myocardial Injury Display Phagocytic Activity Permitting In Vivo Labeling and Tracking. Stem Cells Transl Med. 5 (5), 639-650 (2016).
- Hartwig, S., et al. Secretome profiling of primary human skeletal muscle cells. Biochim Biophys Acta. 1844 (5), 1011-1017 (2014).
- Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation. J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).
- Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts. Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).
- Heller, L. J., Mohrman, D. E. Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).
