Het omgekeerde hartmodel voor de interstitiële transudate-collectie van het Geïsoleerde Rat Hart
Summary
Dit protocol beschrijft een methode om hart interstitiële vloeistof uit het geïsoleerde, geperfuseerde rat hart te verzamelen. Om het interstitiële transudaat fysisch te scheiden van coronaire veneuze effluentperfusaat, wordt het geperfereerde hart van Langendorff omgekeerd en wordt de transudaat (interstitiële vloeistof) gevormd op het hartoppervlak verzameld met behulp van een zachte latexdop.
Abstract
Het onderhavige protocol beschrijft een unieke aanpak die het verzamelen van cardiale transudaat (CT) in staat stelt uit het geïsoleerde, zoutoplossing-geruceerde rat hart. Na de isolatie en retrograde perfusie van het hart volgens de Langendorff techniek, wordt het hart omgekeerd in een ondersteboven positie en wordt mechanisch gestabiliseerd door een ballonkatheter die in de linker ventrikel wordt ingebracht. Vervolgens wordt een dun latexdop – voorheen gegoten die overeenkomt met de gemiddelde grootte van het rathart – over het epicardiale oppervlak geplaatst. De uitlaat van de latexdop is verbonden met siliconenbuis, met de distale opening 10 cm onder het basisniveau van het hart, waardoor een kleine zuigvorming wordt veroorzaakt. CT die voortdurend op het epicardiale oppervlak wordt geproduceerd, wordt verzameld in ijskoude flesjes voor verdere analyse. De snelheid van CT-vorming varieerde van 17 tot 147 μl / min (n = 14) in controle- en infarcte harten, die 0,1-1% van het coronaire veneuze effluentperfusaat vertegenwoordigt. Proteomische analyse en hoge perfoRmance vloeistofchromatografie (HPLC) bleek dat de verzamelde CT een breed spectrum van eiwitten en purinergische metabolieten bevat.
Introduction
Hartfalen (HF) is de belangrijkste doodsoorzaak bij mensen wereldwijd 1 . HF komt vaak voor door myocarditis, ischemische beledigingen voor het myocardium, en linker ventriculaire remodeling, wat leidt tot de progressieve verslechtering van de hartcontractiele functie en de levenskwaliteit van de patiënten. Hoewel de vooruitgang in cardiologie en hartchirurgie de HF-sterfte aanzienlijk verlaagd heeft, dienen zij alleen als voorbijgaande "vertragers" van een onvermijdelijk progressief ziekteproces dat significante morbiditeit draagt. Daarom onderstreept het huidige gebrek aan effectieve behandeling de noodzaak om nieuwe moleculaire doelen te identificeren die HF kunnen voorkomen of zelfs keren. Dit omvat veranderingen in de extracellulaire matrix, ongecontroleerde cardiale immuunrespons en interacties tussen hart- en niet-cardiale cellen 2 .
Het is belangrijk om te erkennen dat de micro-omgeving die hartcellen aan direc zijn blootgesteldTly vormt de immuun- en regeneratieve reactie van het gewonde hart. In het geïsoleerde, zoutoplossende hart wordt CT op het hartoppervlak gegenereerd in de vorm van kleine druppels die afkomstig zijn uit de interstitiële vloeistofruimte ( dwz micro-omgeving), zowel onder fysiologische als pathofysiologische omstandigheden 3 , 4 , 5 . Daarom kan analyse van de CT (interstitiële vloeistof) helpen bij het identificeren van factoren die hart metabolisme en contractiele functie 6 regelen of de immuuncelfuncties beïnvloeden na migratie in het gewond hart. Eventueel kan dit leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor de behandeling van HF.
De collectie van CT uit muizenharten is technisch uitdagend. In regelmatige Langendorff-perfuse harten is de exclusieve collectie CT moeilijk omdat het mengsel van de CT met coronair isY veneuze effluent perfusaat verdient onvoorspelbaar elke concentratie van metabolieten / enzymen die vrijkomen uit de interstitiële ruimte. Een mogelijke strategie om deze beperking te overwinnen is het veneuze effluent uit te sluiten door de pulmonale kannulering en de pulmonale ader 7 gelijktijdig te ligeren. Deze werkwijze is echter geconfronteerd met problemen die verband houden met de kanulatie en ligatie van de pulmonale slagader en ader, waardoor potentiële lekkage van veneus effluent in het harttranssudaat wordt veroorzaakt. Het concept van het gebruik van een omgekeerd hartmodel werd voor het eerst geïntroduceerd door de groep Kammermeier, die het geïsoleerde, geperfumeerde hart in een omgekeerde positie omgekeerde en een dun latexdop op het epicardiale oppervlak plaatste om CT continu aan te nemen zonder de vervuiling van het veneuze effluent 8 , 9 . Met behulp van deze procedure bleek CT te beschikken over een zeer gevoelige maatregel van de metabolieten die uit het hart 9 vrijkomen,De capillaire overdracht van vetzuren 8 en virale deeltjes 10 .
Meer recentelijk hebben paracriene factoren die de lokale immuunrespons kunnen reguleren en cardiale angiogenese 11 kunnen vergroten, betrokken bij de gunstige effecten van stamcellen gebaseerde therapie bij hartziekten. De analyse van CT in het omgekeerde hart kan helpen om deze individuele paracriene factoren chemisch te identificeren. Daarnaast kan CT helpen bij het identificeren van de factoren die betrokken zijn bij de in vivo activering van immuuncellen in het hart.
De gedetailleerde beschrijving van de CT-collectie van het hartoppervlak, dat hier wordt verschaft, is experimenteel nuttig voor onderzoekers die het interactie van immuuncellen, fibroblasten, endotheelcellen en cardiomyocyten interpreteren met betrekking tot de algemene hartfunctie. Zoals hierboven vermeld, draagt de interstitiële vloeistof de informatie voor cel-naar-celcommunicatie binnen het hart, whHet kan gemakkelijk worden beoordeeld door de collectie van CT. De gedetailleerde technische beschrijving, inclusief een videoprotocol om CT van het omgekeerde hart te verzamelen, zou de toekomstige toepassing van deze unieke techniek moeten vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het omgekeerde hartmodel is gebaseerd op de gevestigde Langendorff-hart perfusie-techniek 12 en wordt uitgevoerd door het hart in een omgekeerde positie te omkeren en deze positie vast te houden door middel van een starre intra-ventriculaire ballonkatheter. Op deze manier kan cardiale interstitiële transudaat fysiek gescheiden zijn van coronaire veneuze effluentperfusaat, die door de zwaartekracht van de basis van het hart druppelt. De CT kan continu worden verzameld door middel van een dunne en…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gefinancierd door NSFC 81570244, FoKo 23/2013, en SFB 1116 / B01 en door het Cardiovasculaire Onderzoeksinstituut Düsseldorf (CARID).
Materials
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latexla-tz%E2%80%A8 |
| Aluminum Mold | Home made | – | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | – | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | – | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | – | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | – | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | – | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
Riferimenti
- Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. Death in heart failure: a community perspective. Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).
- Limana, F., et al. Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid. J Mol Cell Cardiol. 48 (4), 609-618 (2010).
- Brunner, F. Cardiac tissue endothelin-1 levels under basal, stimulated, and ischemic conditions. J Cardiovasc Pharmacol. 26, S44-S46 (1995).
- de Lannoy, L. M., et al. Renin-angiotensin system components in the interstitial fluid of the isolated perfused rat heart. Local production of angiotensin I. Hypertension. 29 (6), 1240-1251 (1997).
- Strupp, M., Kammermeier, H. Interstitial Lactate And Glucose-Concentrations Of the Isolated-Perfused Rat-Heart before, during And after Anoxia. Pflugers Arch. 423 (3-4), 232-237 (1993).
- Wienen, W., Jungling, E., Kammermeier, H. Enzyme-Release into the Interstitial Space of the Isolated Rat-Heart Induced by Changes in Contractile Performance. Cardiovasc Res. 28 (8), 1292-1298 (1994).
- De Deckere, E. A., Ten Hoor, ., P, A modified Langendorff technique for metabolic investigations. Pflugers Arch. 370 (1), 103-105 (1977).
- Tschubar, F., Rose, H., Kammermeier, H. Fatty acid transfer across the myocardial capillary wall. J Mol Cell Cardiol. 25 (4), 355-366 (1993).
- Wienen, W., Kammermeier, H. Intra- and extracellular markers in interstitial transudate of perfused rat hearts. Am J Physiol. 254 (4 Pt 2), H785-H794 (1988).
- Sasse, A., Ding, Z. P., Wallich, M., Godecke, A., Schrader, J. Vascular transfer of adenovirus is augmented by nitric oxide in the rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (3), H1362-H1368 (2004).
- Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 103 (11), 1204-1219 (2008).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts. J Vis Exp. (101), e52908 (2015).
- Ding, Z., et al. Epicardium-Derived Cells Formed After Myocardial Injury Display Phagocytic Activity Permitting In Vivo Labeling and Tracking. Stem Cells Transl Med. 5 (5), 639-650 (2016).
- Hartwig, S., et al. Secretome profiling of primary human skeletal muscle cells. Biochim Biophys Acta. 1844 (5), 1011-1017 (2014).
- Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation. J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).
- Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts. Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).
- Heller, L. J., Mohrman, D. E. Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).
