Le modèle de coeur inversé pour la collecte de transudat interstitielle à partir du coeur de rat isolé
Summary
Ce protocole décrit une méthode pour collecter le liquide interstitiel cardiaque à partir du coeur de rat isolé et perfusé. Pour séparer physiquement le transudat interstitiel du perfusat d'effluent veineux coronaire, le coeur perfusé de Langendorff est inversé et le transudat (fluide interstitiel) formé sur la surface cardiaque est recueilli à l'aide d'un cap de latex doux.
Abstract
Le présent protocole décrit une approche unique qui permet la collecte du transudat cardiaque (CT) à partir du coeur isolé et isolé par le sérum physiologique. Après l'isolement et la perfusion rétrograde du cœur selon la technique de Langendorff, le coeur est inversé dans une position à l'envers et est mécaniquement stabilisé par un cathéter à ballonnet inséré dans le ventricule gauche. Ensuite, un mince capuchon en latex – préalablement coulé pour correspondre à la taille moyenne du cœur du rat – est placé sur la surface épicardique. La sortie du capuchon latex est reliée au tube de silicium, avec l'ouverture distale 10 cm au-dessous du niveau de base du coeur, créant une légère aspiration. La CT produite en continu sur la surface épicardique est collectée dans des flacons refroidis par de la glace pour une analyse plus approfondie. Le taux de formation de CT variait de 17 à 147 μL / min (n = 14) dans le contrôle et les cœurs infarctus, ce qui représente 0,1-1% du perfusat effluent veineux coronaire. Analyse protéomique et perfo élevéLa Chromatographie liquide rmance (HPLC) a révélé que le TC recueilli contient un large spectre de protéines et de métabolites purinergiques.
Introduction
L'insuffisance cardiaque (HF) est la principale cause de décès chez les humains dans le monde 1 . L'insuffisance cardiaque survient souvent en raison de la myocardite, des insultes ischémiques au myocarde et du remodelage ventriculaire gauche, entraînant une détérioration progressive de la fonction contractile cardiaque et de la qualité de vie des patients. Bien que les progrès de la cardiologie et de la chirurgie cardiaque ont considérablement diminué la mortalité des HF, ils servent simplement de «retardateurs» transitoires d'un processus de maladie inévitablement progressif qui entraîne une morbidité significative. Par conséquent, le manque actuel de traitement efficace souligne la nécessité d'identifier de nouvelles cibles moléculaires qui peuvent prévenir ou même inverser les HF. Cela inclut les changements dans la matrice extracellulaire, la réponse immunitaire cardiaque incontrôlée et les interactions entre les cellules cardiaques et non cardiaques 2 .
Il est important de reconnaître que le microenvironnement que les cellules cardiaques sont exposées à la directionForme la réponse immunitaire et régénératrice du cœur blessé. Dans le coeur isolé et perfusé par voie saline, le CT est généré sur la surface cardiaque sous la forme de petites gouttelettes dérivées de l'espace interstitiel ( c'est-à-dire le microenvironnement), à la fois dans des conditions physiologiques et physiopathologiques 3 , 4 , 5 . Par conséquent, l'analyse de la CT ( c.-à-d., Le liquide interstitiel) peut aider à identifier les facteurs qui régulent le métabolisme cardiaque et la fonction contractile 6 ou influencent les fonctions des cellules immunitaires après leur migration dans le cœur blessé. Potentiellement, cela peut conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la HF.
La collecte de CT à partir de coeurs murins est techniquement difficile. Dans les coeurs réguliers Langendorff-perfusion, la collection exclusive de CT est difficile car le mélange de CT avec coronarLe perfusif d'effluent veineux dilue de manière imprévisible toute concentration de métabolites / enzymes libérés de l'espace interstitiel. Une stratégie possible pour surmonter cette limitation est d'exclure l'effluent veineux en canulant le système pulmonaire et en ligaturant simultanément la veine pulmonaire 7 . Cependant, cette méthode est confrontée à des difficultés associées à la canulation et à la ligature de l'artère et des veines pulmonaires, provoquant une fuite potentielle d'effluent veineux dans le transjugé cardiaque. Le concept de l'utilisation d'un modèle inverse du cœur a d'abord été introduit par le groupe de Kammermeier, qui a inversé le coeur isolé et perfusé dans une position à l'envers et a placé un mince capuchon latex sur la surface épicardique pour échantillonner continuellement la TDM sans contamination des effluents veineux 8 , 9 . En utilisant cette procédure, CT a montré qu'il fournissait une mesure très sensible des métabolites libérés par le coeur 9 ,Le transfert capillaire d'acides gras 8 et les particules virales 10 .
Plus récemment, les facteurs paracrins qui peuvent réguler la réponse immunitaire locale et augmenter l'angiogenèse cardiaque 11 ont été impliqués dans les effets bénéfiques de la thérapie à base de cellules souches pour les maladies cardiaques. L'analyse de CT dans le coeur inversé peut aider à identifier chimiquement ces facteurs paracrine individuels. En outre, la CT peut aider à identifier les facteurs impliqués dans l'activation in vivo des cellules immunitaires dans le cœur.
La description détaillée de la prise CT de la surface cardiaque, fournie ici, est expérimentalement utile pour les chercheurs qui étudient l'interaction des cellules immunitaires, des fibroblastes, des cellules endothéliales et des cardiomyocytes par rapport à la fonction cardiaque globale. Comme mentionné ci-dessus, le fluide interstitiel porte l'information pour la communication cellulaire à cellulaire dans le cœur, whQui peut être facilement évalué par la collecte de CT. La description technique détaillée, y compris un protocole vidéo sur la façon de collecter le TC à partir du coeur inversé, devrait faciliter l'application future de cette technique unique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modèle de coeur inversé est basé sur la technique de perfusion de cœur de Langendorff bien établie 12 et est réalisé en inversant simplement le cœur en position de renversement et en maintenant cette position à l'aide d'un cathéter à ballonnet intra-ventriculaire rigide. De telle manière, le transjordé interstitiel cardiaque peut être physiquement séparé du perfusat d'effluent veineux coronaire, gouttant par gravité à partir de la base du coeur 9…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par NSFC 81570244, FoKo 23/2013 et SFB 1116 / B01 et par l'Institut de recherche cardiovasculaire Düsseldorf (CARID).
Materials
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latexla-tz%E2%80%A8 |
| Aluminum Mold | Home made | – | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | – | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | – | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | – | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | – | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | – | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
Riferimenti
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