O modelo do coração invertido para a coleta de transudados intersticiais do coração de rato isolado
Summary
Este protocolo descreve um método para coletar fluido intersticial cardíaco a partir do coração de rato perfundido e isolado. Para separar fisicamente o transudado intersticial do perfusado de efluente venoso coronário, o coração perfundido de Langendorff é invertido e o transudado (fluido intersticial) formado na superfície cardíaca é coletado usando um tampão de látex macio.
Abstract
O presente protocolo descreve uma abordagem única que permite a coleta de transudado cardíaco (TC) a partir do coração de rato isolado e com solução salina perfundida. Após o isolamento e a perfusão retrógrada do coração de acordo com a técnica de Langendorff, o coração é invertido em uma posição de cabeça para baixo e é mecanicamente estabilizado por um cateter de balão inserido no ventrículo esquerdo. Então, uma fina tampa de látex – previamente moldada para coincidir com o tamanho médio do coração do rato – é colocada sobre a superfície epicárdica. A saída da tampa de látex está conectada a tubos de silício, com a abertura distal 10 cm abaixo do nível de base do coração, criando leve sucção. O CT produzido continuamente na superfície epicárdica é coletado em frascos refrigerados com gelo para análise posterior. A taxa de formação de CT variou de 17 a 147 μL / min (n = 14) no coração de controle e infarto, o que representa 0,1-1% do perfusado de efluente venoso coronário. Análise proteômica e alto perfoA cromatografia líquida rmance (HPLC) revelou que a TC coletada contém um amplo espectro de proteínas e metabolitos purinérgicos.
Introduction
A insuficiência cardíaca (HF) é a principal causa de morte em seres humanos em todo o mundo 1 . HF freqüentemente ocorre devido a miocardite, insetos isquêmicos ao miocárdio e remodelamento ventricular esquerdo, levando à deterioração progressiva da função contrátil cardíaca e da qualidade de vida dos pacientes. Embora os avanços em cardiologia e cirurgia cardíaca tenham diminuído notavelmente a mortalidade por insuficiência cardíaca, eles apenas servem como "retardantes" transitórios de um processo de doença inevitavelmente progressivo que traz morbidade significativa. Portanto, a atual falta de tratamento efetivo ressalta a necessidade de identificar novos alvos moleculares que podem prevenir ou mesmo reverter a HF. Isso inclui mudanças na matriz extracelular, resposta imune cardíaca não controlada e interações entre células cardíacas e não cardíacas 2 .
É importante reconhecer que o microambiente que as células cardíacas estão expostas à direçãoForja as respostas imunes e regenerativas do coração ferido. No coração isolado, perfumado com solução salina, a TC é gerada na superfície do coração sob a forma de pequenas gotículas derivadas do espaço fluídico intersticial ( ou seja, microambiente), tanto em condições fisiológicas quanto fisiopatológicas 3 , 4 , 5 . Portanto, a análise da TC ( ou seja, o fluido intersticial) pode ajudar a identificar fatores que regulam o metabolismo cardíaco e a função contrátil 6 ou influenciam as funções das células imunes após a migração para o coração ferido. Potencialmente, isso pode levar ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o tratamento da HF.
A coleção de CT de corações murinos é tecnicamente desafiadora. Em corações regulares de Langendorff, a coleção exclusiva de TC é difícil porque a mistura da TC com coronarO perfusor de efluente venoso dilata imprevisivelmente qualquer concentração de metabolitos / enzimas liberadas do espaço intersticial. Uma possível estratégia para superar esta limitação é excluir o efluente venoso por canulação do pulmão e simultaneamente ligando a veia pulmonar 7 . No entanto, esse método enfrenta dificuldades associadas à canulação e à ligação da artéria pulmonar e da veia, causando potencial vazamento de efluente venoso no transudado cardíaco. O conceito de usar um modelo de coração reverso foi introduzido pela primeira vez pelo grupo de Kammermeier, que inverteu o coração isolado e perfundido em uma posição de cabeça para baixo e colocou uma fina tampa de látex na superfície epicárdica para amostrar continuamente a TC sem a contaminação do efluente venoso 8 , 9 . Usando este procedimento, a CT mostrou fornecer uma medida muito sensível dos metabolitos liberados do coração 9 ,A transferência capilar de ácidos gordurosos 8 e partículas virais 10 .
Mais recentemente, fatores paracrinos que podem regular a resposta imune local e aumentar a angiogênese cardíaca 11 foram implicados nos efeitos benéficos da terapia com células-tronco para doenças cardíacas. A análise da TC no coração invertido pode ajudar a identificar quimicamente esses fatores paracrinos individuais. Além disso, a TC pode ajudar a identificar os fatores envolvidos na ativação in vivo de células imunes no coração.
A descrição detalhada da coleta de CT da superfície do coração, fornecida aqui, é experimentalmente útil para pesquisadores que estudam a interação de células imunes, fibroblastos, células endoteliais e cardiomiócitos em relação à função cardíaca geral. Como mencionado acima, o fluido intersticial carrega a informação para comunicação célula a célula dentro do coração, whQue pode ser convenientemente avaliado pela coleção de CT. A descrição técnica detalhada, incluindo um protocolo de vídeo de como coletar CT a partir do coração invertido, deve facilitar a aplicação futura desta técnica única.
Protocol
Representative Results
Discussion
O modelo de coração invertido baseia-se na técnica de perfusão de coração de Langendorff bem estabelecida 12 e é realizado simplesmente invando o coração para uma posição de cabeça para baixo e mantendo esta posição usando um cateter de balão intra-ventricular rígido. De forma tal, o transudato intersticial cardíaco pode ser fisicamente separado do perfusado de efluente venoso coronário, goteando pela gravidade da base do coração 9 . A TC pode ser colet…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financiado pela NSFC 81570244, FoKo 23/2013 e SFB 1116 / B01 e pelo Cardiovascular Research Institute de Düsseldorf (CARID).
Materials
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latexla-tz%E2%80%A8 |
| Aluminum Mold | Home made | – | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | – | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | – | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | – | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | – | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | – | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
Riferimenti
- Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. Death in heart failure: a community perspective. Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).
- Limana, F., et al. Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid. J Mol Cell Cardiol. 48 (4), 609-618 (2010).
- Brunner, F. Cardiac tissue endothelin-1 levels under basal, stimulated, and ischemic conditions. J Cardiovasc Pharmacol. 26, S44-S46 (1995).
- de Lannoy, L. M., et al. Renin-angiotensin system components in the interstitial fluid of the isolated perfused rat heart. Local production of angiotensin I. Hypertension. 29 (6), 1240-1251 (1997).
- Strupp, M., Kammermeier, H. Interstitial Lactate And Glucose-Concentrations Of the Isolated-Perfused Rat-Heart before, during And after Anoxia. Pflugers Arch. 423 (3-4), 232-237 (1993).
- Wienen, W., Jungling, E., Kammermeier, H. Enzyme-Release into the Interstitial Space of the Isolated Rat-Heart Induced by Changes in Contractile Performance. Cardiovasc Res. 28 (8), 1292-1298 (1994).
- De Deckere, E. A., Ten Hoor, ., P, A modified Langendorff technique for metabolic investigations. Pflugers Arch. 370 (1), 103-105 (1977).
- Tschubar, F., Rose, H., Kammermeier, H. Fatty acid transfer across the myocardial capillary wall. J Mol Cell Cardiol. 25 (4), 355-366 (1993).
- Wienen, W., Kammermeier, H. Intra- and extracellular markers in interstitial transudate of perfused rat hearts. Am J Physiol. 254 (4 Pt 2), H785-H794 (1988).
- Sasse, A., Ding, Z. P., Wallich, M., Godecke, A., Schrader, J. Vascular transfer of adenovirus is augmented by nitric oxide in the rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (3), H1362-H1368 (2004).
- Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 103 (11), 1204-1219 (2008).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts. J Vis Exp. (101), e52908 (2015).
- Ding, Z., et al. Epicardium-Derived Cells Formed After Myocardial Injury Display Phagocytic Activity Permitting In Vivo Labeling and Tracking. Stem Cells Transl Med. 5 (5), 639-650 (2016).
- Hartwig, S., et al. Secretome profiling of primary human skeletal muscle cells. Biochim Biophys Acta. 1844 (5), 1011-1017 (2014).
- Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation. J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).
- Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts. Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).
- Heller, L. J., Mohrman, D. E. Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).
