Модель инвертированного сердца для междоузлийной коллекции трансмутаций из изолированного сердца крысы
Summary
В этом протоколе описывается способ сбора сердечной интерстициальной жидкости из изолированного, перфузируемого сердца крыс. Чтобы физически отделить интерстициальный трансудат от перфузата коронарного венозного эффлюента, перфузированное сердце Лангендорфа перевернуто, а транссудатная (интерстициальная жидкость), сформированная на поверхности сердца, собирается с использованием мягкой латексной крышки.
Abstract
В настоящем протоколе описывается уникальный подход, который позволяет собирать сердечный трансудат (КТ) из изолированного, засоленного персистированного сердца крыс. После выделения и ретроградной перфузии сердца в соответствии с техникой Лангендорфа сердце перевернуто в перевернутое положение и механически стабилизируется баллонным катетером, вставленным в левый желудочек. Затем поверх эпикардиальной поверхности помещается тонкая латексная крышка, ранее отлитая в соответствии со средним размером сердца крыс. Выход латексного колпачка соединен с кремниевой трубкой, а дистальное отверстие на 10 см ниже базового уровня сердца, создавая легкое всасывание. Концентрацию, непрерывно продуцируемую на эпикардиальной поверхности, собирают в пробирках с ледяным охлаждением для дальнейшего анализа. Скорость образования КТ варьировалась от 17 до 147 мкл / мин (n = 14) в контроле и инфарктных сердцах, что составляет 0,1-1% от перфузата венозного кровотока коронарных артерий. Протеомический анализ и высокий перфо(ВЭЖХ) показали, что собранный КТ содержит широкий спектр белков и пуринергических метаболитов.
Introduction
Сердечная недостаточность (HF) является основной причиной смерти людей во всем мире 1 . HF часто возникает из-за миокардита, ишемических оскорблений миокарда и ремоделирования левого желудочка, что приводит к прогрессирующему ухудшению сердечной сократительной функции и качества жизни пациентов. Хотя успехи в кардиологии и кардиохирургии значительно снизили смертность от HF, они просто служат временными «задержчиками» неизбежно прогрессирующего процесса болезни, который несет значительную заболеваемость. Поэтому нынешнее отсутствие эффективного лечения подчеркивает необходимость выявления новых молекулярных мишеней, которые могут предотвратить или даже обратить вспять ВЧ. Это включает изменения внеклеточного матрикса, неконтролируемый сердечный иммунный ответ и взаимодействия между сердечными и несердечными клетками 2 .
Важно признать, что микроокружение, которое сердечные клетки подвергаются воздействиюФормирует иммунную и регенеративную реакцию поврежденного сердца. В изолированном, физиологическом растворе сердце, КТ образуется на поверхности сердца в виде небольших капелек, которые получены из интерстициального пространства жидкости ( т. Е. Микроокружения), как в физиологических, так и в патофизиологических условиях 3 , 4 , 5 . Поэтому анализ КТ ( т. Е. Интерстициальной жидкости) может помочь определить факторы, которые регулируют сердечный метаболизм и сократительную функцию 6 или влияют на функции иммунных клеток после миграции в поврежденное сердце. Потенциально это может привести к разработке новых терапевтических стратегий для лечения ВЧ.
Коллекция CT от мышиных сердец технически сложна. В обычных сердцах с перпендикулярным Langendorff эксклюзивная коллекция CT трудна, потому что смесь CT с коронарнойПерфузат венозного эффлюента непредсказуемо разбавляет любую концентрацию метаболитов / ферментов, высвобождаемых из интерстициального пространства. Одна из возможных стратегий преодоления этого ограничения заключается в том, чтобы исключить венозный сток путем канюлирования легочной и одновременной лигирования легочной вены 7 . Однако этот метод сталкивается с трудностями, связанными с канюлированием и лигированием легочной артерии и вены, вызывая потенциальную утечку венозных стоков в сердечный трансудат. Концепция использования модели с обратным сердцем была впервые представлена группой Kammermeier, которая перевернула изолированное перфузированное сердце в перевернутое положение и поместила тонкую латексную крышку на эпикардиальную поверхность для непрерывного отбора КТ без загрязнения венозных стоков 8 , 9 . С помощью этой процедуры показано, что КТ обеспечивает очень чувствительную меру метаболитов, высвобождаемых из сердца 9 ,Капиллярный перенос жирных кислот 8 и вирусных частиц 10 .
Совсем недавно парацерновые факторы, которые могут регулировать местный иммунный ответ и увеличивать сердечный ангиогенез 11 , были связаны с положительным эффектом терапии на основе стволовых клеток при сердечных заболеваниях. Анализ КТ в обратном сердце может помочь химически идентифицировать эти отдельные паракринные факторы. Кроме того, КТ может помочь выявить факторы, связанные с активацией иммунных клеток в организме in vivo .
Подробное описание коллекции CT с поверхности сердца, представленной здесь, экспериментально полезно для исследователей, изучающих взаимодействие иммунных клеток, фибробластов, эндотелиальных клеток и кардиомиоцитов по отношению к общей сердечной функции. Как упоминалось выше, интерстициальная жидкость переносит информацию для связи между клетками внутри сердца, whIch удобно оценивать по набору КТ. Подробное техническое описание, в том числе видео-протокол о том, как собирать КТ из обратного сердца, должно способствовать будущему применению этой уникальной техники.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модель с обратным сердцем основана на хорошо зарекомендовавшем себя методе перфузии сердца Лангендорфа 12 и выполняется простым переворачиванием сердца в перевернутое положение и удерживанием этого положения с использованием жесткого внутрижелудочкового баллонного ка…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось NSFC 81570244, FoKo 23/2013 и SFB 1116 / B01 и Сердечно-сосудистым исследовательским институтом Дюссельдорф (CARID).
Materials
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latexla-tz%E2%80%A8 |
| Aluminum Mold | Home made | – | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | – | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | – | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | – | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | – | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | – | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
Riferimenti
- Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. Death in heart failure: a community perspective. Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).
- Limana, F., et al. Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid. J Mol Cell Cardiol. 48 (4), 609-618 (2010).
- Brunner, F. Cardiac tissue endothelin-1 levels under basal, stimulated, and ischemic conditions. J Cardiovasc Pharmacol. 26, S44-S46 (1995).
- de Lannoy, L. M., et al. Renin-angiotensin system components in the interstitial fluid of the isolated perfused rat heart. Local production of angiotensin I. Hypertension. 29 (6), 1240-1251 (1997).
- Strupp, M., Kammermeier, H. Interstitial Lactate And Glucose-Concentrations Of the Isolated-Perfused Rat-Heart before, during And after Anoxia. Pflugers Arch. 423 (3-4), 232-237 (1993).
- Wienen, W., Jungling, E., Kammermeier, H. Enzyme-Release into the Interstitial Space of the Isolated Rat-Heart Induced by Changes in Contractile Performance. Cardiovasc Res. 28 (8), 1292-1298 (1994).
- De Deckere, E. A., Ten Hoor, ., P, A modified Langendorff technique for metabolic investigations. Pflugers Arch. 370 (1), 103-105 (1977).
- Tschubar, F., Rose, H., Kammermeier, H. Fatty acid transfer across the myocardial capillary wall. J Mol Cell Cardiol. 25 (4), 355-366 (1993).
- Wienen, W., Kammermeier, H. Intra- and extracellular markers in interstitial transudate of perfused rat hearts. Am J Physiol. 254 (4 Pt 2), H785-H794 (1988).
- Sasse, A., Ding, Z. P., Wallich, M., Godecke, A., Schrader, J. Vascular transfer of adenovirus is augmented by nitric oxide in the rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (3), H1362-H1368 (2004).
- Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 103 (11), 1204-1219 (2008).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts. J Vis Exp. (101), e52908 (2015).
- Ding, Z., et al. Epicardium-Derived Cells Formed After Myocardial Injury Display Phagocytic Activity Permitting In Vivo Labeling and Tracking. Stem Cells Transl Med. 5 (5), 639-650 (2016).
- Hartwig, S., et al. Secretome profiling of primary human skeletal muscle cells. Biochim Biophys Acta. 1844 (5), 1011-1017 (2014).
- Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation. J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).
- Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts. Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).
- Heller, L. J., Mohrman, D. E. Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).
