El Modelo Invertido del Corazón para la Colección de Transudado Intersticial del Corazón de la Rata Aislada
Summary
Este protocolo describe un método para recoger fluido intersticial cardíaco del corazón de rata perfundido aislado. Para separar físicamente el transudato intersticial del perfusado de efluente venoso coronario, se invierte el corazón perfundido de Langendorff y se recoge el transudato (líquido intersticial) formado en la superficie cardiaca usando un tapón de látex blando.
Abstract
El presente protocolo describe un enfoque único que permite la recolección de transudado cardíaco (TC) del corazón de rata aislado, con solución salina perfundida. Después del aislamiento y la perfusión retrógrada del corazón de acuerdo con la técnica de Langendorff, el corazón se invierte en una posición invertida y se estabiliza mecánicamente mediante un catéter de balón insertado en el ventrículo izquierdo. Luego, se coloca una tapa delgada de látex – previamente moldeada para que coincida con el tamaño promedio del corazón de la rata – sobre la superficie epicárdica. La salida de la tapa de látex está conectada a tubos de silicio, con la abertura distal 10 cm por debajo del nivel de base del corazón, creando una ligera succión. La TC producida continuamente en la superficie epicárdica se recoge en viales enfriados con hielo para un análisis posterior. La tasa de formación de TC varió de 17 a 147 μL / min (n = 14) en los corazones control y en infarto, lo que representa 0,1-1% del perfusato de efluente venoso coronario. Análisis proteómico y alto perfoLa cromatografía líquida de rmance (HPLC) reveló que la CT recogida contiene un amplio espectro de proteínas y metabolitos purinérgicos.
Introduction
La insuficiencia cardíaca (IC) es la principal causa de muerte en humanos en todo el mundo 1 . La IC suele producirse a causa de miocarditis, inseminación isquémica al miocardio y remodelado ventricular izquierdo, lo que lleva al deterioro progresivo de la función contráctil cardíaca ya la calidad de vida de los pacientes. Aunque los avances en cardiología y cirugía cardíaca han reducido notablemente la mortalidad por HF, sirven meramente como "retardadores" transitorios de un proceso de enfermedad inevitablemente progresivo que tiene una morbilidad significativa. Por lo tanto, la falta actual de tratamiento efectivo subraya la necesidad de identificar nuevos objetivos moleculares que pueden prevenir o incluso revertir la IC. Esto incluye cambios en la matriz extracelular, la respuesta inmune no controlada del corazón, y las interacciones entre las células cardíacas y no cardíacas [ 2] .
Es importante reconocer que el microambiente que las células cardíacas están expuestas a la direcciónTamente la respuesta inmune y regenerativa del corazón lesionado. En el corazón aislado, de perfusión salina, se genera CT en la superficie del corazón en forma de pequeñas gotitas que se derivan del espacio intersticial fluido ( es decir, microambiente), tanto en condiciones fisiológicas como fisiopatológicas 3 , 4 , 5 . Por lo tanto, el análisis de la CT ( es decir, el líquido intersticial) puede ayudar a identificar los factores que regulan el metabolismo cardíaco y la función contráctil 6 o influyen en las funciones de las células inmunes después de la migración en el corazón lesionado. Potencialmente, esto puede conducir al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de la IC.
La recolección de TC a partir de corazones murinos es técnicamente difícil. En los corazones normales de Langendorff-perfundidos, la colección exclusiva de CT es difícil debido a que la mezcla de la CT con la coronariaEl perfusato de efluente venoso diluye impredeciblemente cualquier concentración de metabolitos / enzimas liberados del espacio intersticial. Una estrategia posible para superar esta limitación es excluir el efluente venoso mediante la cánula pulmonar y la ligadura simultánea de la vena pulmonar 7 . Sin embargo, este método enfrenta dificultades asociadas con la canulación y la ligadura de la arteria y vena pulmonar, provocando una fuga potencial de efluente venoso en el transudado cardíaco. El concepto de usar un modelo de corazón reverso fue introducido por primera vez por el grupo de Kammermeier, que invirtió el corazón aislado y perfundido en una posición invertida y colocó una delgada capa de látex en la superficie epicárdica para tomar continuamente CT sin la contaminación del efluente venoso 8 , 9 . Usando este procedimiento, se demostró que la TC proporciona una medida muy sensible de los metabolitos liberados desde el corazón 9 ,La transferencia capilar de ácidos grasos 8 , y partículas virales 10 .
Más recientemente, los factores parácrinos que pueden regular la respuesta inmune local y aumentar la angiogénesis cardíaca 11 se han implicado en los efectos beneficiosos de la terapia basada en células madre para la enfermedad cardíaca. El análisis de la TC en el corazón invertido puede ayudar a identificar químicamente estos factores paracrinos individuales. Además, la TC puede ayudar a identificar los factores implicados en la activación in vivo de las células inmunes en el corazón.
La descripción detallada de la colección de CT desde la superficie del corazón, proporcionada aquí, es experimentalmente útil para los investigadores que estudian la interacción de células inmunitarias, fibroblastos, células endoteliales y cardiomiocitos en relación con la función cardíaca global. Como se mencionó anteriormente, el fluido intersticial lleva la información para la comunicación de célula a célula dentro del corazón,Que se puede evaluar convenientemente mediante la recolección de CT. La descripción técnica detallada, incluyendo un protocolo de vídeo de cómo recolectar CT del corazón invertido, debe facilitar la aplicación futura de esta técnica única.
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo de corazón invertido se basa en la bien establecida técnica de perfusión de corazón de Langendorff 12 y se realiza simplemente invirtiendo el corazón en una posición invertida y manteniendo esta posición usando un catéter de balón intra-ventricular rígido. De esta manera, el transudato intersticial cardíaco puede separarse físicamente del perfusado de efluente venoso coronario, goteando por gravedad desde la base del corazón 9 . El CT se puede recoge…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por NSFC 81570244, FoKo 23/2013 y SFB 1116 / B01 y por el Instituto de Investigación Cardiovascular de Düsseldorf (CARID).
Materials
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latexla-tz%E2%80%A8 |
| Aluminum Mold | Home made | – | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | – | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | – | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | – | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | – | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | – | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
Riferimenti
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