Den inverterade hjärtmodellen för interstitiell transudatsamling från det isolerade råtthjärtat
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att samla hjärtinterstitutionsvätska från det isolerade, perfuserade råtthjärtat. För att fysiskt separera interstitiellt transudat från koronar venöst effluentperfusat, omvandlas Langendorff-perfuserade hjärtat och transudatet (interstitialvätska) som bildas på hjärtytan uppsamlas med användning av en mjuk latexhätta.
Abstract
Det föreliggande protokollet beskriver ett unikt tillvägagångssätt som möjliggör uppsamling av hjärttransversat (CT) från det isolerade, saltlösningsperfuserade råtthjärtat. Efter isolering och retrograd perfusion av hjärtat enligt Langendorff-tekniken är hjärtat inverterat till en upp och ner position och stabiliseras mekaniskt av en ballongkateter insatt i vänstra kammaren. Sedan placeras en tunn latexlock – som tidigare gjutits för att matcha medelstorleken hos råttahjärtat – över epikardialytan. Utsidan av latexlocket är ansluten till kiselröret, med den distala öppningen 10 cm under basens nivånivå, vilket ger en liten sugning. CT som kontinuerligt produceras på epikardialytan uppsamlas i iskylda flaskor för vidare analys. CT-bildningshastigheten varierade från 17 till 147 pi / min (n = 14) i kontroll- och infarkterade hjärtan, vilket representerar 0,1-1% av det perfekta koronarvenösa utflödet. Proteomisk analys och hög perfoRmance vätskekromatografi (HPLC) avslöjade att den uppsamlade CT innehåller ett brett spektrum av proteiner och purinerga metaboliter.
Introduction
Hjärtsvikt (HF) är den främsta orsaken till dödsfall hos människor över hela världen 1 . HF uppträder ofta på grund av myokardit, ischemisk förolämpning mot myokardiet och ombyggnad av vänster kammare, vilket leder till en progressiv försämring av hjärtkontraktil funktion och patienternas livskvalitet. Även om framsteg inom kardiologi och hjärtkirurgi har märkbart sänkt HF-mortalitet, tjänar de bara som övergående "fördröjare" av en oundvikligen progressiv sjukdomsprocess som bär signifikant sjuklighet. Därför understryker den nuvarande bristen på effektiv behandling behovet av att identifiera nya molekylära mål som kan förhindra eller till och med vända HF. Detta inkluderar förändringar i den extracellulära matrisen, okontrollerat hjärtimmunsvar och interaktioner mellan hjärt- och icke-hjärtceller 2 .
Det är viktigt att erkänna att mikromiljön som hjärtceller utsätts för direcTly bildar det skadade hjärtets immun och regenerativa respons. I det isolerade, saltlösningspreparerade hjärtat alstras CT på hjärtytan i form av små droppar som härrör från det interstitiella vätsketrycket ( dvs mikromiljö), både under fysiologiska och patofysiologiska tillstånd 3 , 4 , 5 . Därför kan analys av CT ( dvs interstitiell vätska) bidra till att identifiera faktorer som reglerar hjärtmetabolism och kontraktil funktion 6 eller påverkar immuncellsfunktionerna efter migrering i det skadade hjärtat. Potentiellt kan detta leda till utveckling av nya terapeutiska strategier för behandling av HF.
Samlingen av CT från murina hjärtan är tekniskt utmanande. I vanliga Langendorff-perfuserade hjärtan är den exklusiva samlingen av CT svår eftersom kombinationen av CT med coronarY venös avloppspreparat spädar oförutsägbart någon koncentration av metaboliter / enzymer som frigörs från det interstitiella utrymmet. En möjlig strategi för att övervinna denna begränsning är att utesluta det venösa utflödet genom att cannulera pulmonell och samtidigt ligera lungorna 7 . Emellertid står denna metod inför svårigheter associerade med kanyleringen och ligeringen av lungartären och venen, vilket medför potentiell läckage av venöst utflöde i hjärttransversatet. Konceptet med användning av en omvänd hjärtmodell introducerades först av gruppen Kammermeier som inverterade det isolerade perfuserade hjärtat i en upp och ner position och placerade en tunn latexlock på epikardialytan för att kontinuerligt prova CT utan förorening av venöst utflöde 8 , 9 . Med hjälp av denna procedur visades att CT gav en mycket känslig mätning av de metaboliter som släpptes från hjärtat 9 ,Kapilläröverföringen av fettsyror 8 och virala partiklar 10 .
På senare tid har parakrina faktorer som kan reglera det lokala immunsvaret och förstärka hjärtangiogenesen 11 blivit inblandade i de fördelaktiga effekterna av stamcellerbaserad terapi för hjärtsjukdomar. Analys av CT i det omvända hjärtat kan bidra till att kemiskt identifiera dessa enskilda parakrina faktorer. Dessutom kan CT hjälpa till att identifiera faktorer som är involverade i in vivo aktivering av immunceller i hjärtat.
Den detaljerade beskrivningen av CT-samling från hjärtytan, som tillhandahålls här, är experimentellt användbar för forskare som studerar samspelet mellan immunceller, fibroblaster, endotelceller och kardiomyocyter i förhållande till övergripande hjärtfunktion. Som nämnts ovan bär interstitialvätskan informationen för cell-till-cell-kommunikation inom hjärtat, whDet kan bekvämt bedömas genom insamling av CT. Den detaljerade tekniska beskrivningen, inklusive ett videoprotokoll för hur man samlar in CT från det omvända hjärtat, bör underlätta den framtida tillämpningen av denna unika teknik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den reverserade hjärtmodellen är baserad på den väletablerade Langendorff-hjärtperfusionstekniken 12 och utförs genom att enkelt vrida hjärtat i en upp och ner position och hålla denna position med en styv intra-ventrikulär ballonkateter. På ett sådant sätt kan hjärtinterstitiell transudat separeras fysiskt från koronär venöst utflödesfusus, droppande av gravitation från hjärtat av basen 9 . CT kan kontinuerligt uppsamlas med hjälp av en tunn och flexib…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie finansierades av NSFC 81570244, FoKo 23/2013, och SFB 1116 / B01 och av Cardiovascular Research Institute Düsseldorf (CARID).
Materials
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latexla-tz%E2%80%A8 |
| Aluminum Mold | Home made | – | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | – | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | – | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | – | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | – | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | – | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
Riferimenti
- Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. Death in heart failure: a community perspective. Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).
- Limana, F., et al. Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid. J Mol Cell Cardiol. 48 (4), 609-618 (2010).
- Brunner, F. Cardiac tissue endothelin-1 levels under basal, stimulated, and ischemic conditions. J Cardiovasc Pharmacol. 26, S44-S46 (1995).
- de Lannoy, L. M., et al. Renin-angiotensin system components in the interstitial fluid of the isolated perfused rat heart. Local production of angiotensin I. Hypertension. 29 (6), 1240-1251 (1997).
- Strupp, M., Kammermeier, H. Interstitial Lactate And Glucose-Concentrations Of the Isolated-Perfused Rat-Heart before, during And after Anoxia. Pflugers Arch. 423 (3-4), 232-237 (1993).
- Wienen, W., Jungling, E., Kammermeier, H. Enzyme-Release into the Interstitial Space of the Isolated Rat-Heart Induced by Changes in Contractile Performance. Cardiovasc Res. 28 (8), 1292-1298 (1994).
- De Deckere, E. A., Ten Hoor, ., P, A modified Langendorff technique for metabolic investigations. Pflugers Arch. 370 (1), 103-105 (1977).
- Tschubar, F., Rose, H., Kammermeier, H. Fatty acid transfer across the myocardial capillary wall. J Mol Cell Cardiol. 25 (4), 355-366 (1993).
- Wienen, W., Kammermeier, H. Intra- and extracellular markers in interstitial transudate of perfused rat hearts. Am J Physiol. 254 (4 Pt 2), H785-H794 (1988).
- Sasse, A., Ding, Z. P., Wallich, M., Godecke, A., Schrader, J. Vascular transfer of adenovirus is augmented by nitric oxide in the rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (3), H1362-H1368 (2004).
- Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 103 (11), 1204-1219 (2008).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts. J Vis Exp. (101), e52908 (2015).
- Ding, Z., et al. Epicardium-Derived Cells Formed After Myocardial Injury Display Phagocytic Activity Permitting In Vivo Labeling and Tracking. Stem Cells Transl Med. 5 (5), 639-650 (2016).
- Hartwig, S., et al. Secretome profiling of primary human skeletal muscle cells. Biochim Biophys Acta. 1844 (5), 1011-1017 (2014).
- Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation. J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).
- Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts. Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).
- Heller, L. J., Mohrman, D. E. Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).
