Тюнинг в театре Hippocampal Theta Band<em> In Vitro</em>: Методологии для записи из изолированной цепи грызунов Septohippocampal
Summary
Здесь мы представляем протокол для записи ритмических нейронных сетевых тета и гамма-колебаний из изолированного цельного гиппокампального препарата. Мы описываем экспериментальные этапы извлечения гиппокампа на детали записей о полевых, унитарных и цельных клеточных зажимах, а также оптогенетическую стимуляцию тета-ритма.
Abstract
В этом протоколе описаны процедуры подготовки и записи из изолированного цельного гиппокампа, WT и трансгенных мышей, а также недавние улучшения в методологиях и приложениях для изучения тета-колебаний. Представлена простая характеристика изолированного гиппокампального препарата, в соответствии с которым взаимосвязь между внутренними гиппокампальными тета-осцилляторами исследуется вместе с активностью пирамидальных клеток и ГАМКергических интернейронов областей cornu ammonis-1 (CA1) и суббукула (SUB). В целом, мы показываем, что изолированный гиппокамп способен генерировать собственные тета-колебания in vitro и что ритмичность, генерируемая в гиппокампе, может быть точно манипулирована оптикогенной стимуляцией парвальбумин-положительных (PV) интернейронов. Изолированный гиппокампальный препарат in vitro предлагает уникальную возможность использовать одновременную запись в полевых и внутриклеточных патч-зажимах из визуально идентифицированных neuЧтобы лучше понять механизмы генерации тэта-ритма.
Introduction
Гипокампальные тэта-колебания (4 – 12 Гц) являются одними из наиболее преобладающих форм ритмической активности в мозге млекопитающих и, как полагают, играют ключевые роли в когнитивных функциях, таких как обработка пространственно-временной информации и формирование эпизодических воспоминаний 1 , 2 , 3 . В то время как несколько исследований in vivo , в которых подчеркивается взаимосвязь тетамодифицированных клеток места с исследованиями пространственной навигации и поражения, а также клинические данные, подтверждают мнение о том, что гиппокампальные тэта-колебания участвуют в формировании памяти 4 , 5 , 6 , связанные с механизмом С генерацией тэта-колебаний гиппокампа еще не полностью поняты. Ранние исследования in vivo предполагали, что тета-активность зависит главным образом от внешних осцилляторов, в частности ритмического входаОт афферентных структур головного мозга, таких как перегородка и энторинальная кора 7 , 8 , 9 , 10 . Роль внутренних факторов – внутренней связности нейронных сетей гиппокампа вместе со свойствами нейронов гиппокампа – была также постулирована на основе наблюдений in vitro 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Тем не менее, помимо нескольких знаковых исследований 19 , 20 , 21 , трудности в разработке подходов, которые могли бы воспроизвести физиологически реалистичные активности населения в простой обработке ломтиков in vitroДолгое время откладывали более подробное экспериментальное исследование внутренних свойств гиппокампа и связанных областей с самогенерирующими тета-колебаниями.
Важным недостатком стандартной экспериментальной установки тонких срезов in vitro является то, что трехмерная клеточная и синаптическая организация структур мозга обычно скомпрометирована. Это означает, что многие формы согласованных сетевых действий, основанные на пространственно распределенных ячейках, от локализованных групп (радиус ≤1 мм) до популяций нейронов, расположенных на одной или нескольких участках мозга (> 1 мм), не могут поддерживаться. Учитывая эти соображения, необходим другой тип подхода для изучения того, как возникают тэта-колебания в гиппокампе и распространяются на связанные корковые и подкорковые выходные структуры.
В последние годы начальная разработка «полного септогиппокампа» для изучения двунаправленного взаимодействияctions два структур 22, и последовавшая эволюции препарата «изолированный гиппокампа», показала , что собственные колебания теты возникают спонтанно в гиппокампе не хватает внешний ритмичного входа 23. Значение этих подходов заключается в первоначальном понимании того, что вся функциональная структура этих регионов должна быть сохранена для того, чтобы функционировать как генератор тета-ритма in vitro 22 .
Protocol
Representative Results
Discussion
В то время как электрофизиологические записи из острых гиппокампальных срезов составляют стандартную методику in vitro , представленные здесь методы существенно отличаются от классического подхода. В отличие от препаратов тонкого среза, где определенные клеточные слои видны на пов…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Канадскими институтами исследований в области здравоохранения и естественных наук.
Materials
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 – sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4X6 inch) | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5 / 0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5x objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40x water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made light-emitting diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
Riferimenti
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function. Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).
- O’Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Winson, J. Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat. Science. 201 (4351), 160-163 (1978).
- M’Harzi, M., Jarrard, L. E. Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats. Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).
- Osipova, D., et al. Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory. J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).
- Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. The significance of the rabbit’s septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).
- Mitchell, S. J., Ranck, J. B. Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats. Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).
- Alonso, A., Garcia-Austt, E. Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials. Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).
- Vertes, R. P., Kocsis, B. Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus. Neuroscienze. 81 (4), 893-926 (1997).
- Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices. Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).
- Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons. Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).
- Williams, J. H., Kauer, J. A. Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus. J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).
- Chapman, C. A., Lacaille, J. C. Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing. J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).
- Strata, F. Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation. Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).
- Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis. J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).
- Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands. Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).
- Gillies, M. J., et al. A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1. J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices. Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).
- Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum. J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).
- Amilhon, B., et al. Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency. Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).
- Huh, C. Y., et al. Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm. J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).
- Gu, N., et al. NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks. J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).
- Jackson, J., et al. Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits. Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).
- Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia. Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).
