Tuning dans la bande Hippocampal Theta<em> In Vitro</em>: Méthodologies pour l'enregistrement à partir du circuit de Septohippocampal de Rongeur isolé
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour l'enregistrement du réseau neuronal rythmique theta et les oscillations gamma à partir d'une préparation isolée de l'hippocampe entier. Nous décrivons les étapes expérimentales de l'extraction de l'hippocampe aux détails des enregistrements de pince à lames, à l'unité et à l'ensemble des cellules, ainsi qu'à la stimulation optogénétique du rythme theta.
Abstract
Ce protocole décrit les procédures de préparation et d'enregistrement de l'hippocampe entier isolé, des souris WT et transgéniques, ainsi que des améliorations récentes des méthodologies et des applications pour l'étude des oscillations theta. Une caractérisation simple de la préparation isolée de l'hippocampe est présentée dans laquelle la relation entre les oscillateurs internes de l'thetape de l'hippocampe est examinée conjointement avec l'activité des cellules pyramidales et les interneurones GABAergiques, des domaines cornu ammonis-1 (CA1) et sous -ulum (SUB). Dans l'ensemble, nous montrons que l'hippocampe isolé est capable de générer des oscillations theta intrinsèques in vitro et que la rythmicité générée dans l'hippocampe peut être manipulée avec précision par la stimulation optogénétique des interneurones positives à la parvalbumine (PV). La préparation in vitro isolée de l'hippocampe offre une occasion unique d'utiliser simultanément des enregistrements de pince-plaie intracellulaires et champêtres à partir d'un neu visuellement identifiéAfin de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent la génération du rythme theta.
Introduction
Les oscillations de l'hippocampal theta (4 à 12 Hz) sont parmi les formes les plus prédominantes d'activité rythmique chez le cerveau mammalien et sont censés jouer un rôle clé dans les fonctions cognitives telles que le traitement de l'information spatio-temporelle et la formation de souvenirs épisodiques 1 , 2 , 3 . Alors que plusieurs études in vivo qui mettent en évidence la relation des cellules place-modulées avec des études de navigation spatiale et des lésions, ainsi que des preuves cliniques, étayent la vision selon laquelle les oscillations de theta de l'hippocampe sont impliquées dans la formation de mémoire 4 , 5 , 6 , les mécanismes associés Avec la génération des oscillations de theta de l'hippocampe sont encore pas complètement compris. Les premières études in vivo ont suggéré que l'activité theta dépendait principalement des oscillateurs extrinsèques, en particulier de l'entrée rythmiqueÀ partir de structures cérébrales afférentes telles que le septum et le cortex entorhinal 7 , 8 , 9 , 10 . Un rôle pour les facteurs intrinsèques – la connectivité interne des réseaux de neurones de l'hippocampe avec les propriétés des neurones de l'hippocampe – a également été postulé sur la base d'observations in vitro 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Cependant, en dehors de quelques études marquantes 19 , 20 , 21 , des difficultés dans l'élaboration d'approches qui pourraient reproduire des activités de population physiologiquement réalistes dans une préparation simple de tranche in vitroS ont, depuis longtemps, retardé un examen expérimental plus détaillé des capacités intrinsèques de l'hippocampe et des zones apparentées à l'auto-génération des oscillations theta.
Un inconvénient important de la configuration expérimentale standard de la coupe mince in vitro est que l'organisation cellulaire et synaptique 3D des structures cérébrales est habituellement compromise. Cela signifie que de nombreuses formes d'activités de réseau concertées basées sur des assemblages cellulaires distribués spatialement, allant des groupes localisés (rayon ≤ 1 mm) aux populations de neurones réparties sur une ou plusieurs zones cérébrales (> 1 mm), ne peuvent pas être supportées. Compte tenu de ces considérations, un autre type d'approche était nécessaire pour étudier la façon dont les oscillations theta apparaissent dans l'hippocampe et se propagent à des structures de sortie corticales et subcorticales apparentées.
Au cours des dernières années, le développement initial de la préparation «sépto-hippocampique complète» pour examiner les interiraux bidirectionnelsLes cisions des deux structures 22 et l'évolution qui en a résulté de la préparation du «hippocampe isolé» ont révélé que les oscillations intrinsèques de theta se produisent spontanément dans l'hippocampe dépourvue d'entrée rythmique externe 23 . La valeur de ces approches repose sur l'idée initiale selon laquelle toute la structure fonctionnelle de ces régions devait être préservée afin de fonctionner comme un générateur de rythme theta in vitro 22 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que les enregistrements électrophysiologiques à partir de tranches d'hippocampe aiguë constituent une technique standard in vitro , les méthodes présentées ici diffèrent sensiblement de l'approche classique. Contrairement aux préparations en tranche mince où des couches cellulaires spécifiques sont visibles à la surface et peuvent être examinées directement, les préparations intactes d'hippocampe sont plus proches des configurations in vivo où les électrodes so…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les Instituts de recherche en santé et sciences naturelles du Canada.
Materials
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 – sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4X6 inch) | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5 / 0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5x objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40x water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made light-emitting diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
Riferimenti
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