हिप्पोकैम्पल थीटा बैंड में ट्यूनिंग<em> विट्रो में</em>: अलगाववादी कृंतक सेप्टोशिपोकैम्पल सर्किट से रिकॉर्डिंग के लिए तरीके
Summary
यहाँ, हम एक पृथक पूरे हिप्पोकैम्पल तैयारी से लयबद्ध न्यूरोनल नेटवर्क थीटा और गामा दोलन रिकॉर्ड करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम क्षेत्र, एकात्मक और पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के साथ-साथ थीटा ताल के ऑप्टोजेनेटिक पेसिंग के विवरण के लिए हिप्पोकैम्पस की निकासी से प्रयोगात्मक कदम का वर्णन करते हैं।
Abstract
इस प्रोटोकॉल ने थलटा ओसीलेसमेंट के अध्ययन के तरीकों और अनुप्रयोगों में हालिया सुधारों के साथ-साथ, WT और ट्रांसजेनिक चूहों के पृथक पूरे हिप्पोकैम्पस से तैयार करने और रिकॉर्डिंग के लिए प्रक्रियाओं की रूपरेखा की है। पृथक हिप्पोकैम्पल तैयारी का एक सरल लक्षण वर्णन प्रस्तुत किया जाता है जिससे आंतरिक हिप्पोकैम्पल थीटा ऑसिलेटर्स के बीच संबंधों को पिरामिड कोशिकाओं की गतिविधि और कॉर्नो अम्मोनीस -1 (सीए 1) और सबिकुलम (उप) क्षेत्र के गैबर्जर इन्टरनेट्स के साथ जांच की जाती है। कुल मिलाकर, हम दिखाते हैं कि पृथक हिप्पोकैम्पस इन विट्रो में आंतरिक थिटा दोलन पैदा करने में सक्षम है और हिप्पोकैम्पस के भीतर उत्पन्न तालबद्धता को परवलबिमिन-पॉजिटिव (पीवी) इंटरन्युनोन के ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना से ठीक से हेरफेर किया जा सकता है। इन विट्रो पृथक हिप्पोकैम्पल तैयारी नेत्रहीन रूप से पहचाना नू से एक साथ क्षेत्र और इंट्रासेल्युल्युलर पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता हैचूहों थेटा लय पीढ़ी के अंतर्निहित तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए।
Introduction
हिप्पोकैम्पल थीटा दोलन (4 – 12 हर्ट्ज) स्तनधारी मस्तिष्क में लयबद्ध गतिविधि के सबसे प्रमुख रूपों में से हैं और माना जाता है कि स्पाटियेटमॉम्रल सूचनाओं के प्रसंस्करण और प्रासंगिक यादों 1 , 2 , 3 के गठन के रूप में संज्ञानात्मक कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाएं। जबकि विवो अध्ययन में कई लोग जो स्थानिक नेविगेशन और घाव के अध्ययन के साथ थीटा-मॉड्यूड प्लेस-कोशिकाओं के रिश्ते को उजागर करते हैं, साथ ही साथ नैदानिक सबूत, हिप्पोकैम्पल थीटा दोलन स्मृति संरचना 4 , 5 , 6 में शामिल हैं , तंत्र से संबंधित हिप्पोकैम्पल थीटा दोलनों के उत्पादन के साथ अभी भी पूरी तरह से समझा नहीं जाता है। विवो जांच के शुरुआती दिनों में सुझाव दिया गया कि थीटा गतिविधि मुख्य रूप से बाहरी थरथरानियों पर निर्भर करती है, विशेष तालबद्ध इनपुट मेंसेप्टम और एंटोराहिनल कॉर्टेक्स 7 , 8 , 9 , 10 जैसे अभिरुचि मस्तिष्क संरचनाओं से। आंतरिक कारकों के लिए एक भूमिका – हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के गुणों के साथ हिप्पोकैम्पल न्यूरल नेटवर्क की आंतरिक कनेक्टिविटी – इन विट्रो टिप्पणियों 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 में आधारित थी । हालांकि, कुछ मील का पत्थर अध्ययन 1 9 , 20 , 21 के अलावा , विकासशील दृष्टिकोणों में कठिनाइयां जो इन विट्रो टुकड़ों की तैयारी में आसान में शारीरिक रूप से यथार्थवादी आबादी गतिविधियों को दोहरा सकते हैंलंबे समय तक, हिप्पोकैम्पस और संबंधित क्षेत्रों की आंतरिक क्षमताओं की अधिक विस्तृत प्रयोगात्मक परीक्षा में स्वयं-जनित थिटा दोलनों के लिए लंबित है।
इन विट्रो पतली-टुकड़ा प्रयोगात्मक सेटिंग में मानक के एक महत्वपूर्ण नकारात्मक पक्ष यह है कि मस्तिष्क संरचनाओं के 3 डी सेलुलर और अन्तर्ग्रथनी संगठन आमतौर पर समझौता कर रहे हैं। इसका मतलब है कि स्थानीय समूहों (≤ 1 मिमी त्रिज्या) से एक या अधिक मस्तिष्क क्षेत्रों (> 1 मिमी) में फैले न्यूरॉन्स की आबादी के लिए, विभाजित सेल असेंबलियों के आधार पर ठोस नेटवर्क गतिविधियों के कई रूप समर्थित नहीं हो सकते। इन विचारों को देखते हुए, अध्ययन करने के लिए एक अलग प्रकार के दृष्टिकोण की आवश्यकता थी कि कैसे थिओ ओसीलाइजेशन हिप्पोकैम्पस में उभरकर और संबंधित कॉर्टिकल और उप-आउटपुट आउटपुट संरचनाओं के बारे में फैलता है।
हाल के वर्षों में, द्विदिश आंतों की जांच करने के लिए "पूर्ण septo-hippocampal" तैयारी का प्रारंभिक विकासदो संरचनाओं के अनुच्छेद 22 , और "पृथक हिप्पोकैम्पस" तैयारी के आगामी उत्थान से पता चला है कि आंतरिक थिटा दोलन हिप्पोकैम्पस में सहज होते हैं जो बाहरी लयबद्ध इनपुट 23 की कमी होती है इन तरीकों का मूल्य प्रारंभिक अंतर्दृष्टि पर आधारित है कि इन क्षेत्रों की संपूर्ण कार्यात्मक संरचना इन विट्रो 22 में थीटा ताल जनरेटर के रूप में कार्य करने के लिए संरक्षित की जानी थी।
Protocol
Representative Results
Discussion
जबकि तीव्र हिप्पोकैम्पल स्लाइस से इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग इन विट्रो तकनीक में एक मानक हैं, यहां प्रस्तुत विधियां क्लासिक दृष्टिकोण से काफी भिन्न हैं। पतली टुकड़े की तैयारी के विपर?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान और प्राकृतिक विज्ञान संस्थानों द्वारा समर्थित था।
Materials
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 – sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4X6 inch) | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5 / 0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5x objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40x water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made light-emitting diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
Riferimenti
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