Tuning en la banda Theta Hippocampal<em> In Vitro</em>: Metodologías para la grabación del circuito septohippocampal de roedores aislados
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la grabación de la red neuronal rítmica teta y oscilaciones gamma de una preparación de hipocampo aislado todo. Describimos los pasos experimentales desde la extracción del hipocampo hasta los detalles de las grabaciones de parches de campo, unitarios y de células enteras, así como la estimulación optogenética del ritmo teta.
Abstract
Este protocolo describe los procedimientos para la preparación y registro del hipocampo entero aislado, de WT y ratones transgénicos, junto con mejoras recientes en metodologías y aplicaciones para el estudio de las oscilaciones de theta. Se presenta una caracterización simple de la preparación aislada del hipocampo mediante la cual se examina la relación entre los osciladores internos de la teta del hipocampo junto con la actividad de las células piramidales y las interneuronas GABAérgicas de las áreas cornu ammonis-1 (CA1) y subiculum (SUB). En general, se demuestra que el hipocampo aislado es capaz de generar oscilaciones intrínsecas de theta in vitro y que la ritmicidad generada dentro del hipocampo puede manipularse con precisión mediante la estimulación optogenética de interneuronas positivas a parvalbúmina (PV). La preparación hippocampal aislada in vitro ofrece una oportunidad única de usar grabaciones simultáneas en campo y intracelular de patch-clamp de neu visualmente identificadoPara comprender mejor los mecanismos subyacentes a la generación del ritmo theta.
Introduction
Las oscilaciones de la teta del hipocampo (4 – 12 Hz) están entre las formas más predominantes de actividad rítmica en el cerebro de los mamíferos y se cree que desempeñan papeles clave en funciones cognitivas como el procesamiento de la información espaciotemporal y la formación de memorias episódicas 1 , 2 , 3 . Mientras que varios estudios in vivo que ponen de relieve la relación de la teta modulada lugar de las células con la navegación espacial y la lesión estudios, así como la evidencia clínica, apoyan la opinión de que el hipocampo theta oscilaciones están involucrados en la memoria formación 4 , 5 , 6 , los mecanismos asociados Con la generación de oscilaciones de la teta del hipocampo todavía no se entienden completamente. Las investigaciones tempranas in vivo sugirieron que la actividad de theta dependía principalmente de osciladores extrínsecos, en particular de entrada rítmicaDe estructuras cerebrales aferentes como el septo y la corteza entorrinal 7 , 8 , 9 , 10 . Un papel para los factores intrínsecos – conectividad interna de las redes neuronales del hipocampo junto con las propiedades de las neuronas del hipocampo – también se postuló sobre la base de observaciones in vitro 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Sin embargo, aparte de unos cuantos estudios históricos 19 , 20 , 21 , las dificultades en el desarrollo de enfoques que podrían reproducir las actividades fisiológicamente realistas de la población en la preparación de la rebanada in vitro simpleS han retrasado durante mucho tiempo un examen experimental más detallado de las capacidades intrínsecas del hipocampo y áreas relacionadas para autogenerar oscilaciones teta.
Un inconveniente importante de la norma in vitro de corte fino de ajuste experimental es que la organización celular 3D y sináptica de las estructuras cerebrales se ve generalmente comprometida. Esto significa que no se pueden apoyar muchas formas de actividades de redes concertadas basadas en conjuntos de células distribuidas espacialmente, que van desde grupos localizados (≤1 mm de radio) hasta poblaciones de neuronas diseminadas a través de una o más áreas cerebrales (> 1 mm). Teniendo en cuenta estas consideraciones, un tipo diferente de enfoque fue necesario para estudiar cómo teta oscilaciones emergen en el hipocampo y propagar a corticales relacionados y subcortical las estructuras de salida.
En los últimos años, el desarrollo inicial de la "completa septo-hipocampo" preparación para examinar intera bidireccionalCiones de las dos estructuras 22 y la consiguiente evolución de la preparación del "hipocampo aislado", han revelado que las oscilaciones intrínsecas de la teta ocurren espontáneamente en el hipocampo sin entrada rítmica externa 23 . El valor de estos enfoques reside en la idea inicial de que toda la estructura funcional de estas regiones tenía que ser conservado con el fin de funcionar como un generador de ritmos theta in vitro [ 22] .
Protocol
Representative Results
Discussion
Mientras que las grabaciones electrofisiológicas de cortes de hipocampo agudo constituyen una técnica in vitro estándar, los métodos aquí presentados difieren sustancialmente del enfoque clásico. A diferencia de las preparaciones de rebanadas finas donde las capas celulares específicas son visibles en la superficie y pueden ser examinadas directamente, las preparaciones intactas del hipocampo se asemejan más a configuraciones in vivo en las que los electrodos se bajan en regiones cerebrales dir…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y Ciencias Naturales.
Materials
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 – sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4X6 inch) | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5 / 0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5x objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40x water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made light-emitting diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
Riferimenti
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