Qui presentiamo un protocollo per registrare la teoria ritmica della rete neuronale e le oscillazioni gamma da una preparazione interamente isolata di ippocampo. Descriviamo le fasi sperimentali dall'estrazione dell'ippocampo ai dettagli del campo, delle registrazioni a blocchi di patch patch unitari e intere cellule, nonché della stimolazione ottogenetica del ritmo theta.
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Articolo metodologico
Tuning nella Banda Theta Ippocampale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive le procedure per la preparazione e la registrazione dall'ippocampo intero isolato, dai topi transgenici e dai topi transgenici, nonché dai recenti miglioramenti nelle metodologie e nelle applicazioni per lo studio delle oscillazioni. Viene presentata una semplice caratterizzazione della preparazione ippocampale isolata, in cui viene analizzata la relazione tra oscillatori ippocampali theta e l'attività delle cellule piramidali e degli interneuroni GABAergici delle aree cornu ammonis-1 (CA1) e subiculum (SUB). Nel complesso mostriamo che l'ippocampo isolato è in grado di generare oscillazioni di theta intrinseche in vitro e che la ritmicità generata all'interno dell'ippocampo può essere manipolata in modo preciso dalla stimolazione ottogenetica di interneuroni parvalbuminici (PV). Il preparato ippocampo isolato in vitro offre un'occasione unica per utilizzare registrazioni simultanee di campo e intracellulari da un patch-clamp da identificazioni visivamente identificatePer capire meglio i meccanismi che sottendono alla generazione del ritmo theta.
Introduzione
Le oscillazioni di theta ippocampali (4-12 Hz) sono tra le forme più prevalenti di attività ritmica nel cervello dei mammiferi e si credono a svolgere ruoli chiave nelle funzioni cognitive quali elaborazione di informazioni spaziali e formazione di memorie episodiche 1 , 2 , 3 . Mentre diversi studi in vivo che evidenziano il rapporto delle cellule place-theta modulate con studi di navigazione spaziale e lesioni, nonché prove cliniche, supportano la visione che le oscillazioni ippocampali sono coinvolte nella formazione della memoria 4 ,....
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Protocollo
Tutte le procedure sono state eseguite secondo protocolli e linee guida approvate dal comitato McGill University Animal Care e dal Canadian Council on Animal Care.
1. Preparazione acuta di ippocampo in vitro
NOTA: L'isolamento della preparazione ippocampale intatta comporta tre fasi principali: (1) Preparazione di soluzioni e attrezzature, (2) Dissection dell'ippocampo e (3) Impostazione del sistema di velocità di perfusione veloce necessaria per la generazione di oscillazioni theta intrinseca. In questo protocollo, la tempestiva esecuzione delle procedure - dalla dissezione alla registrazione -....
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Risultati
Questa sezione illustra esempi di risultati che possono essere ottenuti studiando le oscillazioni di theta nella preparazione ippocampale isolata in mouse in vitro . La procedura di dissezione per estrarre l'ippocampo isolato è illustrata in Figura 1 . Utilizzando questa preparazione, le oscillazioni di theta intrinseca possono essere esaminate durante il posizionamento di elettrodi di campo multiplo, registrando l'attività complessiva.......
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Discussione
Mentre le registrazioni elettrofisiologiche da fette acute di ippocampo costituiscono una tecnica standard in vitro , i metodi presentati qui differiscono sostanzialmente dal metodo classico. A differenza delle preparazioni sottili di fetta dove sono visibili strati cellulari specifici sulla superficie e possono essere esaminati direttamente, i preparati ippocampali intatti sono più simili alle configurazioni in vivo in cui gli elettrodi vengono abbassati in regioni cerebrali mirate attraversando singo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun interesse commerciale o finanziario concorrente.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dagli Istituti Canadesi di Salute e Scienze Naturali.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 - sodio fosfato monobasico | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Solfato di magnesio | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Cloruro di potassio | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucosio | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Cloruro di calcio diidrato | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Ascorbato di sodio | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Equipment | |||
| Forbici da dissezione standard | Fisher Scientific | 08-951-25 | |
| Manico per bisturi per estrazione cerebrale #4, 14 cm | WPI | 500237 | per l'estrazione del cervello |
| Filtro pinze, ganasce piatte, diritte (11 cm) | WPI | 500456 | estrazione cerebrale |
| Lame per bisturi in acciaio inossidabile Paragon #20 | Ultident | 02-90010-20 | estrazione cerebrale |
| Forbici da dissezione curve a punta fine | Thermo Fisher Scientific | 711999 | estrazione cerebrale |
| Spatola sottile rivestita in teflon (PTFE) | VWR | 82027-534 | preparazione |
| ippocampaleHayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | preparazione ippocampale |
| Cucchiaio da laboratorio | Fisher Scientific | 14-375-20 | preparazione ippocampale |
| Vetro borosilicato Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | preparazione ippocampale |
| Droper | Fisher Scientific | preparazione ippocampale | |
| Lame da barba a taglio singolo | VWR | 55411-055 | preparazione dell'ippocampo |
| Carta per lenti (4 x 6") | VWR | 52846-001 | preparazione dell'ippocampo |
| Piastre di Petri in vetro (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | preparazione dell'ippocampo |
| Vassoio di plastica per ghiaccio; dimensioni 30 x 20 x 5 cm | n.a.n.a.preparazione | dell'ippocampo | |
| Riscaldatore per soluzione in linea singola Warner | Instruments | SH-27B | sistema di perfusione |
| Acquario pietre porose per gorgogliare | n.a.n.a.perfusion | system | |
| Tygon E-3603 tubo (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | sistema di perfusione |
| Electric Skillet | Black & Sistema di | perfusione | n.a. |
| 95% O2/5% CO2 miscela di gas (carbogeno) | perfusione | SG466204A | Vitalaire |
| Bottiglie/fiaschi di vetro (4 x 1 L) | n.a.n.a.sistema | perfusione | |
| Camera di registrazione sommersa | design personalizzato (FM) | n.a.Possono | essere utilizzate alternative commerciali |
| Pipette in vetro (1,5/0,84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | elettrofisiologia |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Elettrofisiologia | Q-Humbug |
| Amplificatore patch-clamp Multiclamp 700B | Dispositivi molecolari | Elettrofisiologia | MULTICLAMP |
| 700B Programma Commander | Dispositivi molecolari | Elettrofisiologia | MULTICLAMP |
| Convertitore digitale/analogico | Dispositivi molecolari | Elettrofisiologia | DDI440 |
| PCLAMP10 | Dispositivi | molecolariPCLAMP10 | elettrofisiologia |
| Tabella di isolamento dalle vibrazioni | Newport | n.a.elettrofisiologia | |
| Micromanipolatori (azionati manualmente) | Siskiyou | MX130 | elettrofisiologia (LFP) |
| Micromanipolatori (automatizzati) | Siskiyou | MC1000e | elettrofisiologia (patch) |
| Monitor audio | A-M Systems | Modello 3300 | elettrofisiologia |
| Estrattore di pipette per micropipette/patch | Sutter | P-97 | elettrofisiologia |
| Microscopio a fluorescenza verticale su misura | Siskiyou | n.a.Imaging | |
| Videocamera analogica | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Frame grabber digitale con software di imaging | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Obiettivo Olympus 2.5X | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40X obiettivo a immersione in acqua | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Sistema di diodi a emissione di luce (LED) su misura | n.a.stimolazione | optogenetica personalizzata (Amhilon et al., 2015) | |
| Name | Company | Numero di catalogo | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) topi | Jackson Laboratory | codice 008069 | Permette Espressione genica cre-diretta negli interneuroni PV |
| Topi Ai9 costitutiva-condizionale (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | codice 007905 | Express TdTomato dopo la ricombinazione Cre-mediata |
| Ai32 topi (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock numero 012569 | Esprimono la proteina di fusione canalerodopsina-2/EYFP migliorata dopo l'esposizione a Cre topi ricombinasi |
| PVChY | Allevamento domestico | n.a. | Prole ottenuta dall'incrocio della linea PV-Cre con topi Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
Riferimenti
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J.
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Ristampe e permessi
