N型糖鎖アレイ開発および HIV 抗体のための化学酵素合成プロファイリング
Summary
酸化アルミニウム コーティング ガラスに添付ファイルのN型糖鎖の合成にモジュラー アプローチは、糖鎖マイクロ アレイを開発し、広く中和抗体、HIV のプロファイリングの使用が示されている (ACG スライド) をスライドさせます。
Abstract
Nの広い範囲の急速な準備のための非常に効率的な方法を提案する-人間の糖タンパク質でよく見られる (20,000 構造を超過する推定) オリゴ糖をリンクします。目的の構造の多様性を達成するために戦略から始まった、3 –Oと 6 –Oで彼らの段階的 α-選択的グリコシル化に続いて、oligosaccharyl フッ化物モジュールの 3 種類の化学酵素合成の位置、重要な β-マンノシドのリンケージを持つ共通のコア三のマンノース残基。我々 はさらに、HIV 抗体とヘテロ-リガンド相互作用の分析のための共有結合混合配列を作成する酸化アルミニウム コーティング ガラス (ACG) スライドの表面にN型糖鎖を添付しました。特に、バインディング動作を新たに単離した HIV 1 広く中和抗体 (bNAb)、PG9、密接に間隔をあけられた男5GlcNAc2の混合物の (男5) と 2, 6-ジ-還元末端 bi antennary 複合型N型糖鎖 (SCT) ACG 配列の HIV ワクチン開発のための効果的な免疫原設計に新しい道を開きます。また、ACG 配列は異種リガンド結合動作の他の HIV 抗体を研究する強力なツールを体現しています。
Introduction
糖タンパク質糖鎖のN共有にリンクされて、アスパラギン コンセンサス Asn-Xxx-セリン/スレオニン sequon の (Asn) 残基蛋白質の構造、抗原性、溶解性、レクチン認識などいくつかの生物学的プロセスに影響を与える1,2。 Nの化学合成-糖鎖は彼らの巨大な構造マイクロ不均一性と高分岐建築のため重要な合成挑戦を表します。保護を慎重に選択グループ ビルディング ブロック、アノマー中心とプロモーターの適切な使用に選択性を達成するための反応性を調整する/activator(s) 複雑なオリゴ糖の合成における重要な要素です。N型糖鎖の合成を進める作業の偉大な量が報告された複雑なこの問題を解決するために最近3,4。これらの堅牢なアプローチにもかかわらず、(〜 20,000) 残る主要な挑戦のN型糖鎖の広い範囲の準備のための効果的な方法を見つけること。
広範な遺伝的多様性と中和抗体から脱出する能力を達成するために HIV-1 の急速な突然変異率は HIV 15,6に対して安全と予防ワクチンの開発に最大の課題の一つです。,7. HIV を使用してホストの免疫反応を回避する 1 つの効果的な戦術は多様なN封筒糖蛋白質 gp120 の翻訳後修飾糖鎖-ホスト糖機械8から派生した糖鎖のリンク 9。人間の萌芽期の腎臓 (HEK) 293 t 細胞からの組換えの単量体 1 HIV gp120 糖鎖の精密解析に関する最近の報告書は、セル固有の特徴10構造異種性の発生を示唆しています。,11,12します。 したがって、HIV-1 bNAbs の糖鎖特異性も特徴と gp120 が必要です理解関連N型糖鎖構造解析のための十分な量で。
糖鎖マイクロ アレイの技術の発見は、炭水化物結合蛋白質、ウイルス/細菌アドヘシン、毒素、抗体、および lectines1314,の多様な範囲の特異性の高スループットに基づく探査を提供.アレイ チップ ベース形式で体系的な糖鎖の配置は、多価プレゼンテーション15,16,17,18まで問題となる低親和性タンパク質糖鎖の相互作用を決定でした。このチップに基づく糖鎖の配置が効果的に細胞インターフェイスを模倣する便利に表示されます。技術を豊かにし従来の配列形式に関連付けられているムラの問題を克服する、私たちのグループは最近ホスホン酸終わった糖鎖を使用して信号強度を高めるのに酸化アルミニウム コーティング ガラス (ACG) スライドの糖鎖アレイを開発均一性、そして感度19,20。
新たに単離した HIV 1 広く中和抗体 (bNAbs) の糖鎖エピトープに関する現在の理解を向上させるため、我々 はNの広範な配列の準備のための高効率モジュール戦略を開発している-リンク糖鎖21 、、ACG に印刷される22スライド (図 1参照)。ACG 配列の HIV-1 bNAbs のプロファイリング研究を提供して非常に強力な bNAb HIV からが分離された PG9 のヘテロ糖鎖連結動作の異常検出感染個人23,24,25特異性。
Protocol
Representative Results
Discussion
HIV 1 菌株を循環の 70-80% の中和に非常に強力なことは、HIV-1 bNAbs PGTs 128、PG16、PG9 141-145 を含むのクラスが報告されました。これらの bNAbs のエピトープが全体の HIV-1 グループ M の変種の間で非常に節約される、従って彼らは23,抗体中和24,25 を引き出すために HIV ワクチンの有効な免疫原設計をガイドがあります。.、HIV-1 広?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、薄いフィルム技術部門、楽器技術研究センター (ITRC) と国立応用研究所、台湾・新竹サイエン スパークにありがとうございます。この作品は、国家科学委員会によって支えられた (付与なし。ほとんど 105-0210-01-13-01) と中央研究院。
Materials
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 64197 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 75058 | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 108247 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | Sigma Aldrich | 7487889 | |
| Boron trifluoride ethyl etherate | Sigma Aldrich | 109637 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 9048468 | |
| Bio-Gel P2 polyacrylamide | Bio-Rad | 1504118 | |
| Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride | Sigma Aldrich | 12116664 | |
| β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk | Sigma Aldrich | 48279 | |
| BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) | Arrayit | ||
| Cerium ammonium molybdate | TCI | C1794 | |
| Cerium ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 16774213 | |
| Clean glass slide | Schott | ||
| Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid | Sigma Aldrich | 3063716 | |
| Deuterated chloroform | Sigma Aldrich | 865496 | |
| Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated | Jackson Immuno Research, USA | 709605098 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 75092 | |
| Diethylaminosulfur trifluoride | Sigma Aldrich | 38078090 | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 68122 | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 141786 | |
| Ethylene glycol | Acros Organic | 107211 | |
| FAST frame slide incubation chambers | Sigma Aldrich | ||
| Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt | Sigma Aldrich | 15839700 | |
| Lab tracer 2.0 software | Section 4 of the Protocol | ||
| GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) | moleculardevices | www.moleculardevices.com | |
| GraphPad Prism Software (Image processing ) | GraphPad Software, Inc | http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ | |
| Lithium hydroxide | Sigma Aldrich | 1310652 | |
| Manganese chloride | Sigma Aldrich | 7773015 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67561 | |
| N-butanol | Sigma Aldrich | 71363 | |
| Oxalic acid | Acros Organic | 144627 | |
| Palladium hydroxide | Sigma Aldrich | 12135227 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110861 | |
| P-Toluene sulfonic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 773476 | |
| Silver triflate | Sigma Aldrich | 2923286 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 7647145 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium methoxide | Sigma Aldrich | 124414 | |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 7757826 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 108883 | |
| Tris buffer | Amresco | N/A | Ultra-pure grade |
| Tween-20 | Amresco | 9005645 | |
| Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) | Sigma Aldrich | 137868521 |
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