Le sauvetage et la caractérisation du virus recombinant à partir d'un nouveau clone infectieux du virus Zika du monde
Summary
Ce protocole décrit la récupération du virus Zika infectieux à partir d'un clone d'ADNc infectieux à deux plasmides.
Abstract
Les clones d'ADNc infectieux permettent une manipulation génétique d'un virus, facilitant ainsi le travail sur les vaccins, la pathogenèse, la replication, la transmission et l'évolution virale. Nous décrivons ici la construction d'un clone infectieux pour le virus Zika (ZIKV), qui provoque actuellement une épidémie explosive dans les Amériques. Pour éviter toute toxicité pour les bactéries qui sont communément observées avec les plasmides dérivés du flavivirus, nous avons généré un système à deux plasmides qui sépare le génome du gène NS1 et est plus stable que les constructions complètes qui ne peuvent pas être récupérées avec succès sans mutations. Après la digestion et la ligature pour rejoindre les deux fragments, l'ARN viral complet peut être généré par une transcription in vitro avec de l'ARN polymérase T7. Après l'électroporation de l'ARN transcrit dans les cellules, le virus a été récupéré qui a montré une cinétique de croissance in vitro similaire et des phénotypes de virulence et d'infection in vivo chez les souris et les moustiques, respectivement.
Introduction
Le virus Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genre Flavivirus ) est un flavivirus transmis par des moustiques qui est arrivé au Brésil en 2013-14 et a ensuite été associé à une épidémie massive de maladie fébrile qui s'est répandue dans les Amériques 1 . En outre, le ZIKV a été lié à des résultats sévères liés à la maladie, tels que le syndrome de Guillain-Barré chez les adultes et la microcéphalie chez les fœtus et les nouveau-nés 2 . On savait peu à propos de ZIKV avant sa propagation rapide dans l'hémisphère occidental. Cela comprenait un manque d'outils moléculaires, entravant ainsi la recherche mécanique. Les outils moléculaires pour les virus, tels que les clones d'ADNc infectieux, facilitent le développement thérapeutique des vaccins et des antiviraux et permettent l'évaluation des facteurs génétiques viraux liés à la pathogenèse virale différentielle, à la réponse immunitaire et à l'évolution virale.
Les clones infectieux de Flavivirus sont connus pour être très instables dans les bactéries en raison de crLes promoteurs procaryotes yptiques présents dans leurs génomes 3 . Plusieurs approches ont été utilisées pour améliorer ce problème; Y compris l'insertion de répétitions en tandem en amont des séquences virales 4 , la mutation des séquences promoteurs procaryotes putatives 5 , le fractionnement du génome dans de multiples plasmides 6 , des vecteurs numériques à faible copie (y compris les chromosomes artificiels bactériens) 7 , 8 et l'insertion d'introns dans le génome viral 9 . Un système complet sans modifications a été décrit pour ZIKV; Cependant, ce clone semble être atténué dans la culture cellulaire et chez la souris 10 . D'autres groupes ont incorporé des introns dans le génome de ZIKV, permettant une perturbation de séquences instables dans des bactéries qui peuvent être épissées dans des cellules de mammifères in vitro pour la production de virus infectieux 11, 12 . En outre, un système basé sur la PCR intitulé Infectious-Subgenomic-Amplicons a été utilisé avec succès pour sauver le prototype de souche MR766 de ZIKV 13 . L'approche décrite ici ne nécessite pas de séquences étrangères, mais perturbe le génome dans la région d'une forte instabilité en utilisant de multiples plasmides, qui ont déjà été utilisés avec succès avec la fièvre jaune 6 , la dengue 14 , 15 et le virus du Nil occidental 16 . En outre, l'addition de la séquence de ribozyme de l'hépatite D au niveau de la terminaison génomique virale facilite la création d'une fin authentique 3 'sans avoir besoin d'ajouter un site de linéarisation. En outre, les deux plasmides sont construits dans un vecteur à nombre de copies faible (pACYC177, ~ 15 copies par cellule) pour atténuer toute toxicité résiduelle 17 . Le virus récupéré affiche un profil de croissance comparable àVirus parental dans les courbes de croissance in vitro dans 8 lignées cellulaires comprenant une variété de types de cellules dérivées à la fois de mammifères et d'insectes et a présenté des profils pathogènes identiques chez la souris et les taux d'infection, de diffusion et de transmission chez les moustiques 18 .
Dans ce document, nous détaillons un protocole décrivant comment développer les plasmides de clones infectieux, générer de l'ARN viral complet (le génome viral) in vitro et récupérer le virus infectieux dans la culture cellulaire. Tout d'abord, nous décrivons la propagation de plasmides dans des bactéries ou une amplification sans bactéries à l'aide de l'amplification du cercle circulant (RCA). Ensuite, nous montrons comment les deux plasmides sont digérés puis ensuite ligaturés ensemble pour générer des virus complets. Enfin, nous décrivons la production de l'ARN transcrit et son électroporation subséquente dans les cellules Vero, suivi du titrage du virus récupéré ( Figure 1 ). L'approche décrite est rapide, ce qui permetR récupération des stocks de virus infectieux en 1-2 semaines.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic et Claudia Rückert pour leur aide dans la caractérisation du virus dérivé du clone. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de l'Institut national d'allergie et de maladies infectieuses, NIH sous les subventions AI114675 (BJG) et AI067380 (GDE).
Materials
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
| Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
| T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
| T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12 well plate | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
| Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
Riferimenti
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