एक नई दुनिया Zika वायरस संक्रमित क्लोन से पुनः संयोजक वायरस के बचाव और विशेषता
Summary
यह प्रोटोकॉल संक्रामक Zika वायरस की दो-प्लाज्मिड संक्रामक सीडीएनए क्लोन से पुनर्प्राप्ति का वर्णन करता है।
Abstract
संक्रामक सीडीएनए क्लोन वायरस के आनुवंशिक हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं, इस प्रकार टीके, रोगजनन, प्रतिकृति, संचरण और वायरल विकास पर काम करने में मदद करते हैं। यहां हम ज़िका वायरस (जेडआईकेवी) के लिए संक्रामक क्लोन के निर्माण का वर्णन करते हैं, जो वर्तमान में अमेरिका में एक विस्फोटक प्रकोप पैदा कर रहा है। आमतौर पर फ्लैविवायरस-व्युत्पन्न प्लास्मिड के साथ जीवाणुओं को विषाक्तता को रोकने के लिए, हमने एक दो-प्लाज्मिड प्रणाली उत्पन्न की जो एनएस 1 जीन में जीनोम को अलग करती है और पूर्ण-लंबाई वाले निर्माणों से अधिक स्थिर होती है, जो उत्परिवर्तनों के बिना सफलतापूर्वक पुनर्प्राप्त नहीं की जा सकती। दो टुकड़ों में शामिल होने के लिए पाचन और बंधन के बाद, पूर्ण लंबाई वाले वायरल आरएनए इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ के साथ उत्पन्न हो सकता है। कोशिकाओं में लिखित आरएनए के इलेक्ट्रोप्लोरेशन के बाद, वायरस को वसूला गया था जो कि इन विट्रो विकास कैनेटीक्स में और विवो विषाक्तता और चूहों और मच्छरों में संक्रमण के phenotypes में क्रमशः प्रदर्शित किया गया था।
Introduction
ज़िका वायरस (जीआईआईकेवी; फ़ैमिली फ्लैविविरिडे : जीनस फ्लैवियरस ) एक मच्छर से पैदा हुआ फ्लैवियर है जो 2013-14 में ब्राजील पहुंचा था और बाद में अमेरिका के 1 में फैल जाने वाली बुखार की बीमारी के बड़े पैमाने पर फैलने से जुड़ा था। इसके अलावा, ZIKV गंभीर रोग परिणामों से जुड़ा हुआ है, जैसे कि वयस्कों में गिलेन-बैर सिंड्रोम और भ्रूणों और नवजात 2 में माइक्रोसेफली। पश्चिमी गोलार्ध में तेज़ी से फैल जाने से पहले ज़िंक के बारे में बहुत कुछ जाना जाता था। इसमें आणविक टूल की कमी शामिल है, इस प्रकार तंत्रिकी अनुसंधान में बाधा है। वायरस के लिए आणविक उपकरण, जैसे संक्रामक सीडीएनए क्लोन, वैक्सीन और एंटीवायरल चिकित्सीय विकास की सुविधा प्रदान करते हैं, और वायरल आनुवांशिक वायरल रोगजनन, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और वायरल विकास से जुड़े वायरल आनुवंशिक कारकों के मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं।
फ्लैवियरस संक्रामक क्लोन सीआर के कारण बैक्टीरिया में अत्यधिक अस्थिर होने के कारण जाना जाता हैYptic prokaryotic प्रमोटर अपने जीनोम में मौजूद 3 इस समस्या को सुधारने के लिए कई तरीकों का इस्तेमाल किया गया है; अग्रगण्य अनुक्रमों के ऊपर की तरफ दोहराता सहित 4 , उत्परिवर्तित प्रोकर्यियोटिक प्रमोटर अनुक्रम 5 का उत्परिवर्तन, कई प्लाज्मिड में जीनोम को विभाजित करना 6 , कम प्रतिलिपि संख्या वैक्टर (बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्रों सहित) 7 , 8 और वायरल जीनोम में इंट्रंस को सम्मिलित करना 9 । संशोधनों के बिना एक पूर्ण लंबाई प्रणाली को ZIKV के लिए वर्णित किया गया है; हालांकि, इस क्लोन को सेल संस्कृति और चूहों 10 में तनु बना दिया गया । अन्य समूहों ने जीआईकेवी जीनोम में प्रवेश किया है, जिससे बैक्टीरिया में अस्थिर अनुक्रमों के विघटन की अनुमति मिलती है, जो इन विट्रो में स्तनधारी कोशिकाओं में संक्रामक वायरस के उत्पादन के लिए बाहर की जा सकती है।, 12 इसके अतिरिक्त, पीसीआईआर-आधारित सिस्टम नामक संक्रमित-उप-आनुवंशिक-एम्प्लिक्सन को सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है जो कि ZIKV 13 के प्रोटोटाइप MR766 तनाव को बचाता है। यहां वर्णित दृष्टिकोण के लिए कोई विदेशी अनुक्रम नहीं है, बल्कि कई प्लास्मिड का उपयोग करके उच्च अस्थिरता के क्षेत्र में जीनोम को बाधित करता है, जिसे पहले पीले बुखार 6 , डेंगू 14 , 15 और पश्चिम नाइल वायरस 16 के साथ सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, वायरल जीनोमिक टर्मिनिनी में हेपेटाइटिस डी रिबोयोइम अनुक्रम के अलावा एक रैखिकरण साइट के अलावा बिना किसी प्रामाणिक 3 'अंत के निर्माण की सुविधा है। इसके अतिरिक्त, किसी भी अवशिष्ट विषाक्तता को कम करने के लिए दोनों प्लास्मिड कम प्रतिलिपि संख्या वेक्टर (pACYC177, ~ 15 प्रति प्रति प्रति सेल) में बनाए गए हैं इस वायरस को ठीक से वृद्धि प्रोफाइल प्रदर्शित करता है जो इसके लिए तुलनीय हैइन विट्रो वृद्धि में माता-पिता का वायरस 8 सेल लाइनों में घटता है, जिसमें विभिन्न प्रकार के स्तनधारी और कीड़ों से प्राप्त सेल प्रकार होते हैं, और मच्छरों में संक्रमण, फैलाव और ट्रांसमिशन दरों में समान रोगजनक प्रोफाइल का प्रदर्शन किया है।
इस प्रकार, हम संक्रामक क्लोन प्लास्मिड को विकसित करने के तरीके के बारे में एक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं , इन विट्रो में पूर्ण लंबाई वाले वायरल आरएनए (वायरल जीनोम) उत्पन्न करते हैं और सेल संस्कृति में संक्रामक वायरस को पुनर्प्राप्त करते हैं। सबसे पहले, हम रोलिंग सर्कल प्रवर्धन (आरसीए) का उपयोग कर बैक्टीरिया या जीवाणु-मुक्त प्रवर्धन में प्लास्मिड के प्रसार का वर्णन करते हैं। इसके बाद, हम दिखाते हैं कि कैसे दो प्लास्मिड को पचाने जाते हैं और फिर बाद में पूर्ण लंबाई वाली वायरस उत्पन्न करने के लिए एक साथ ligated। अंत में, हम लिखित आरएनए और इसके बाद के electroporation का उत्पादन वेरो कोशिकाओं में करते हैं, जिसके बाद वसूली के वायरस ( चित्रा 1 ) का अनुकरण किया जाता है। वर्णित दृष्टिकोण तेजी से, के लिए अनुमति है1-2 सप्ताह में संक्रामक वायरस शेयरों की वसूली।
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
क्लोन व्युत्पन्न वायरस को दर्शाने में उनकी सहायता के लिए लेखक क्रिस्टन बलार्ड-फेबेलमेन, मिलिना वेसेलिनोविक और क्लाउडिया रुक्कर्ट का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। एनआईएच अनुदान के तहत AI114675 (बीजीजी) और एआईटी 67380 (जीडीई) के राष्ट्रीय अनुदान संस्थान, एलआईजी और संक्रामक रोगों से अनुदान के द्वारा इस काम का समर्थन किया गया था।
Materials
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
| Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
| T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
| T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12 well plate | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
| Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
Riferimenti
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome–case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveill. 19 (9), (2014).
- Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5′ end of dengue virus RNA genome. PLoS One. 6 (3), e18197 (2011).
- Pu, S. Y., et al. A novel approach to propagate flavivirus infectious cDNA clones in bacteria by introducing tandem repeat sequences upstream of virus genome. J Gen Virol. 95 (Pt 7), 1493-1503 (2014).
- Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
- Rice, C. M., Grakoui, A., Galler, R., Chambers, T. J. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol. 1 (3), 285-296 (1989).
- Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
- Gualano, R. C., Pryor, M. J., Cauchi, M. R., Wright, P. J., Davidson, A. D. Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2 using stably cloned genomic-length cDNA. J Gen Virol. 79 (Pt 3), 437-446 (1998).
- Johansen, I. E. Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (22), 12400-12405 (1996).
- Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence, Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
- Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
- Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
- Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497, 157-162 (2016).
- Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain). Gene. 162 (2), 175-180 (1995).
- Messer, W. B., et al. Development and characterization of a reverse genetic system for studying dengue virus serotype 3 strain variation and neutralization. PLoS Negl Trop Dis. 6 (2), e1486 (2012).
- Kinney, R. M., et al. Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus. J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).
- Chang, A. C., Cohen, S. N. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. 91 (1), (2017).
- Roberts, P. L., Lloyd, D. Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography. Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. (93), e52065 (2014).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. , (2016).
- Grubaugh, N. D., et al. Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching. Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).
