Redning og karakterisering av rekombinant virus fra en ny verden Zika Virus smittsom klon

Summary

Denne protokollen beskriver utvinningen av smittsomt Zika-virus fra en to-plasmidinfeksjonell cDNA-klon.

Abstract

Infeksiøse cDNA kloner tillater genetisk manipulering av et virus, og dermed letter arbeidet med vaksiner, patogenese, replikasjon, overføring og viral evolusjon. Her beskriver vi konstruksjonen av en smittsom klon for Zika virus (ZIKV), som for tiden forårsaker et eksplosivt utbrudd i Amerika. For å forhindre toksisitet for bakterier som vanligvis observeres med flavivirus-avledede plasmider, genererte vi et to-plasmidsystem som separerer genomet ved NS1-genet og er stabile enn full lengdekonstruksjoner som ikke kunne bli vellykket gjenopprettet uten mutasjoner. Etter fordøyelse og ligering for å bli med i de to fragmentene, kan full lengde viralt RNA genereres ved in vitro transkripsjon med T7 RNA polymerase. Etter elektroporering av transkribert RNA i celler ble virus gjenvunnet som utviste tilsvarende in vitro vekstkinetikk og in vivo virulens- og infeksjonsfenotyper hos henholdsvis mus og mygg.

Introduction

Zika-virus (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) er et mygg-båret flavivirus som kom til Brasil i 2013-14 og ble senere assosiert med et massivt utbrudd av feber sykdom som spredte seg over hele Amerika ¹ . I tillegg har ZIKV vært knyttet til alvorlige sykdomsutfall, slik som Guillain-Barré syndrom hos voksne og mikrocefali hos foster og nyfødte ² . Det var lite kjent om ZIKV før den raske spredningen i den vestlige halvkule. Dette innebar mangel på molekylære verktøy, og dermed hindret mekanistisk forskning. Molekylære verktøy for virus, som infeksiøse cDNA kloner, lette vaksine og antiviral terapeutisk utvikling, og tillate vurdering av virale genetiske faktorer relatert til differensiell viral patogenese, immunrespons og viral evolusjon.

Flavivirusinfeksjonelle kloner er kjent for å være svært ustabile i bakterier på grunn av crYptiske prokaryote promotorer tilstede i deres genomene ³ . Flere tilnærminger har blitt brukt til å lette dette problemet; Inkludert innføring av tandemrepetater oppstrøms for virussekvenser ⁴ , mutasjon av antatte prokaryotiske promotorsekvenser ⁵ , splittelse av genomet i flere plasmider ⁶ , lavkopi-talvektorer (inkludert bakterielle kunstige kromosomer) ^{7 , 8} og innsetting av introner i virusgenomet ⁹ . Et full lengdesystem uten endringer er beskrevet for ZIKV; Denne klonen syntes imidlertid å bli dempet i cellekultur og hos mus ¹⁰ . Andre grupper har konstruert introner i ZIKV-genomet, som tillater forstyrrelse av ustabile sekvenser i bakterier som kan spaltes ut i pattedyrceller in vitro for produksjon av smittsomt virus ^{11, 12} . I tillegg er et PCR-basert system med navnet infektiøse-subgenomic-Amplicons blitt brukt med hell for å redde prototypen MR766-stammen av ZIKV ¹³ . Tilnærmingen beskrevet her krever ingen utenlandske sekvenser, men forstyrrer snarere genomet i regionen med høy ustabilitet ved bruk av flere plasmider, som tidligere har blitt brukt med hell med feber ⁶ , dengue ^{14 , 15} og West Nile-virus ¹⁶ . Videre letter tilsetningen av hepatitt D-ribozym-sekvensen ved den virale genomiske termini opprettelsen av en autentisk 3'-ende uten behov for tilsetning av et lineariseringssted. I tillegg er begge plasmidene konstruert i en vektor med lav kopi-tall (pACYC177, ~ 15 kopier per celle) for å redusere eventuell gjenværende toksisitet ¹⁷ . Viruset som er gjenopprettet, viser en vekstprofil som kan sammenlignes medForeldringsvirus i in vitro vekstkurver i 8 cellelinjer omfattende en rekke celletyper avledet fra både pattedyr og insekter, og har utvist identiske patogene profiler i mus og infeksjon, spredning og overføringshastigheter i mygg ¹⁸ .

Her beskriver vi en protokoll som beskriver hvordan man dyrker de smittsomme klonplasmidene, genererer full lengde viralt RNA (det virale genomet) in vitro, og gjenoppretter smittsomt virus i cellekultur. Først beskriver vi forplantning av plasmider i bakterier eller bakteriefri forsterkning ved bruk av rullesirkelforsterkning (RCA). Deretter viser vi hvordan de to plasmidene blir fordøyd og deretter ligert sammen for å generere fulllengdsvirus. Til slutt beskriver vi produksjonen av transkribert RNA og dets etterfølgende elektroporation i Vero-celler, etterfulgt av titrering av gjenvunnet virus ( Figur 1 ). Tilnærmingen beskrevet er rask, slik at foR gjenoppretting av smittsomme viruslagre i 1-2 uker.

Protocol

1. Transformasjon og gjenvinning av smittsomme klonplasmider Transform begge plasmidene (separat) ved hjelp av en kommersiell transformasjonsprotokoll ( f.eks . NEB 5 Minute Transformation Protocol) med noen modifikasjoner. Begge plasmidene inneholder et gen som koder for ampicillinresistens, derfor bruk ampicillin eller carbenicillin for seleksjon. Carbenicillin er foretrukket, da det er mer stabilt. Fjern celler (se materialetabell) fra -80 ° C fryser og tine på is i 5-1…

Representative Results

Protokollen beskrevet her muliggjør utvinning av infeksiøst klonavledet Zika-virus. Manipulering av det to-plasmidinfeksjonelle klonsystemet er rettferdig når det utføres med forsiktighet, sammenlignet med full lengdeversjoner som er svært ustabile (data ikke vist). Etter fordøyelse og ligering av de to adskilte stykkene, blir takket RNA fremstilt ved bruk av in vitro transkripsjon med T7-polymerase, som deretter elektroporeres i Vero-celler ( Figur 1<…

Discussion

Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode…

Materials

NEB Stable CompetentE. coli	New England BioLabs	C3040H
Carbenicillin, Disodium Salt	various
Zyppy Plasmid Miniprep Kit	Zymo Research	D4036
ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit	Zymo Research	D4202
SalI-HF	New England BioLabs	R3138S	20,000 units/ml
NheI-HF	New England BioLabs	R3131S	20,000 units/ml
ApaLI	New England BioLabs	R0507S	10,000 units/ml
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S	20,000 units/ml
BamHI-HF	New England BioLabs	R3136S	20,000 units/ml
HindIII-HF	New England BioLabs	R3104S	20,000 units/ml
illustra TempliPhi 100 Amplification Kit	GE Healthcare Life Sciences	25640010
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609.5
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	New England BioLabs	M0371S	1,000 units/ml
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)	New England BioLabs	M0290S	10,000 units/ml
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202S	400,000units/mL
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit	New England BioLabs	E2065S
Vero cells	ATCC	CCL-81
ECM 630 High Throughput Electroporation System	BTX	45-0423	Other machines are acceptable.
LB Broth with agar (Miller)	Sigma	L3147	Can be homemade as well.
Terrific Broth	Sigma	T0918	Can be homemade as well.
Petri Dish	Celltreat	229693
Culture Tubes	VWR International	60818-576
T75 flasks	Celltreat	229340
T182 flasks	Celltreat	229350
1x PBS	Corning	21-040-CV
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose	Corning	10-017-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlas Biologicals	FP-0500-A
Tragacanth Powder	MP Bio	MP 104792
Crystal Violet	Amresco	0528-1006
Ethanol Denatured	VWR International	BDH1156-1LP
6 well plate	Celltreat	229106
12 well plate	Celltreat	229111
Sequencing Oligos	IDT	see table 1
Qubit 3.0	ThermoFisher	Qubit 3.0	other methods are acceptable.
Qubit dsDNA BR Assay Kit	ThermoFisher	Q32850	other methods are acceptable.
Qubit RNA HS Assay Kit	ThermoFisher	Q32852	other methods are acceptable.
Class II Biosafety Cabinet	Varies	N/A	This is necessary for live-virus work.