Измеряя эндоцитоза синаптических пузырьков в культивированный Нейроны гиппокампа
Summary
Синаптических пузырьков эндоцитоза обнаруживается световой микроскопии pHluorin сливается с синаптических пузырьков белка и электронной микроскопии везикул поглощения.
Abstract
Во время эндоцитоза расплавленный синаптических пузырьков извлекаются на нервные окончания, позволяя для рециркуляции везикул и, таким образом, поддержание синаптической передачи во время повторяющихся нервных стрельбы. Нарушением эндоцитоза в патологических условиях приводит к уменьшается в синаптической силы и мозга функции. Здесь мы описываем методы, используемые для измерения эндоцитоза синаптических пузырьков на млекопитающих гиппокампа синапсов в нейрональных культуры. Мы мониторинг синаптических пузырьков белка эндоцитоза путем сплавления синаптических везикулярного мембранный белок, включая synaptophysin и VAMP2/Синаптобревин, на стороне везикулярного lumenal, с pHluorin, рН чувствительных Зеленый флуоресцирующий белок, который увеличивает его увеличивает интенсивность флуоресценции как pH. Во время экзоцитоз везикулярной люмен рН увеличивается, тогда как во время эндоцитоза везикулярного люмен рН восстановления подкисленных. Таким образом увеличение интенсивности флуоресценции pHluorin указывает фьюжн, а уменьшение эндоцитоза помечены синаптических пузырьков белка. Помимо использования метода pHluorin изображений для записи эндоцитоза, мы контролируется везикулярного мембраны эндоцитоза измерениями электронной микроскопии (EM) хрен пероксидазы (ПХ) поглощения везикулы. Наконец мы за формирование нервных терминал мембраны ямы в разное время после высокой калия индуцированной деполяризации. Время курс HRP поглощения и мембраны яму формирования указывает время курс эндоцитоз.
Introduction
Медиаторы хранятся в синаптических пузырьков и выпущенный экзоцитоз. Синаптических везикул мембранных белков затем учитываются путем эндоцитоза и повторно в следующем раунде экзоцитоз. Эндоцитоза синаптических пузырьков имеет важное значение для поддержания синаптических пузырьков бассейны и удаляет выступающих везикулы от плазматической мембраны. РН чувствительных Зеленый флуоресцирующий белок pHluorin, которая угасает в кислотных обстоятельствах и dequenched в нейтральном pH, был использован для измерения времени эндоцитоза курсы в живой клетки1,2,3. PHluorin белок обычно прикрепляется к lumenal стороне синаптических пузырьков белков, таких как synaptophysin или VAMP2/Синаптобревин. В состоянии покоя pHluorin закаленного в 5,5 рН люмен синаптических пузырьков. Сплавливание Vesicle к плазматической мембраны предоставляет везикулярного просвета в внеклеточной решение, где pH ~ 7.3, что привело к увеличению в pHluorin флуоресценции. После экзоцитоз увеличение флуоресценции распадов, благодаря эндоцитоза синаптических пузырьков белков, следуют везикул повторного подкисления в рамках этих восстановленных везикулы. Хотя распад отражает эндоцитоза и везикулярного восстановление подкисления, она главным образом отражает эндоцитоза, потому что восстановление подкисления быстрее, чем эндоцитоза в большинстве условий1,4. Постоянная времени восстановления подкисления является 3-4 s или менее5,6, который обычно быстрее, чем 10 s или более необходимые для везикул эндоцитоза4,5. Если эксперименты необходимо различать эндоцитоза от повторного подкисления, кислоты тушения эксперименты, используя 4-Morpholineethanesulfonic кислота (MES) решение (25 мм) с рН 5,5 может использоваться для определения, извлекаются ли белки синаптических пузырьков из плазматической мембраны через эндоцитоза1,3,4. Таким образом увеличение интенсивности флуоресценции pHluorin отражает баланс экзо – и эндоцитоза, и уменьшение после стимуляции нерва конкретно отражает эндоцитоз.
pHluorin изображений может использоваться не только для того, чтобы измерить время курс эндоцитоза, но и размер синаптических пузырьков бассейны7,8, и вероятность вызвали выпуска и спонтанное выпуск9. Многие факторы и белков, участвующих в регулировании эндоцитоза, таких как кальций, растворимые NSF-вложение белка рецептора (SNARE) белки, factor(BDNF) мозга нейротрофического и кальциневрина были определены с использованием pHluorin изображений1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. Кроме того, освобождение нейромедиатора могут быть обнаружены в нейроны не только основного, но в нейробластома клеток с TIRFM17. Недавно варианты pHluorin, dsRed, mOrange и pHTomato были разработаны для мониторинга одновременной записи множества факторов в одном синапса18,19. К примеру pHTomato сливается с synaptophysin и используется с индикатором генетически закодированный кальция (GCaMP5K) для мониторинга Пресинаптический везикул фьюжн и Ca2 + приток в постсинаптической отсека20. Таким образом pHluorin, придает синаптических белков предоставляет полезный метод для анализа взаимосвязи между эндоцитоза и экзоцитоз.
EM является еще одним методом, обычно используется для изучения эндоцитоза, благодаря высоким пространственным разрешением, которая показывает ультраструктурные изменения во время эндоцитоз. Две общие области являются способность визуализировать патологические изменения в нейрональных клеток21 и отслеживать везикул белки22. В частности наблюдение за поглощение синаптических пузырьков, мембраны кривизны покрытием Клатрин в зоне periactive, и от англ структуры возможны с EM3,23,24,25 ,26,27,28. В то время как EM включает потенциальных артефактов, таких как фиксатор индуцированной пороков, которые могут повлиять на эндоцитоза, и анализ данных является трудоемким, резолюция обеспечивает привлекательной возможностью для визуализации клеточной структуры. Под высоким давлением, замораживания, предоставляя быстрый и не химический метод стабилизации деликатные структуры, присутствующие во время эндоцитоза27может преодолеть потенциальные фиксирующие проблемы и ограничения в EM временное разрешение.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы продемонстрировать два метода для мониторинга синаптических пузырьков эндоцитоз. В первом методе мы наблюдает pHluorin сливается с протеином синаптических пузырьков в transfected нейронов и впоследствии электрически стимулировали. Во-вторых мы использовали EM изображений HRP поглощен?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Ён-Линг Zhu за предоставление synaptophysin-pHluorin2x конструкцию и д-р Джеймс э. Ротман для обеспечения VAMP2-phluorin. Мы благодарим д-р Сьюзен Чэн и Вирджиния Crocker NINDS микроскопии фонда за их техническую поддержку и помощь. Эта работа была поддержана Национальный институт неврологических нарушений и инсульта интрамуральных исследовательской программы в США и Грант от KRIBB исследовательской инициативе программы (корейский биомедицинских ученый программа стипендий), Корея научно-исследовательский институт Бионауки и биотехнологии, Республика Корея.
Materials
| Lipofectamine LTX with Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin |
| neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use |
| B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | Gradient for neuronal differentiation |
| Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | Gradient for neuronal culture |
| Poly-D-Lysine coated coverslip | Neuvitro | GG-25-pdl | Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin |
| Trypsin XI from bovine pancrease | Sigma | T1005 | Neuronal culture-digest hippocampal tissues |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 | Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension |
| pulse stimulator | A-M systems | model 2100 | Apply electrical stimulation |
| Slotted bath with field stimulation | Warner Instruments | RC-21BRFS | Apply electrical stimulation |
| stimulus isolation unit | Warner Instruments | SIU102 | Apply electrical stimulation |
| lubricant | Dow corning | 111 | pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber |
| AP5 | Tocris | 3693 | Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| CNQX | Tocris | 190 | Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| Illuminator | Nikon | C-HGFI | Metal halide light source for pHluorin |
| EMCCD camera | Andor | iXon3 | pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity |
| Inverted microscopy | Nikon | Ti-E | Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells |
| NIS-Elements AR | Nikon | NIS-Elements Advanced Research | Software for imaging acquisition and analysis |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for imaging analysis and data presentation |
| imaging chamber | Warner Instruments | RC21B | pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells |
| poly-l-lysine | Sigma | P4832 | Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times |
| Horseradish peroxidase(HRP) | Sigma | P6782 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use |
| Na cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N |
| 3,3′-Diaminobenzidine(DAB) | Sigma | D8001 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16365 | Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use |
| TEM | JEOL | 200CX | Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes |
| CCD digital camera | AMT | XR-100 | Electron microscopy, capturing images |
| Lead citrate | Leica microsystems | 16707235 | Electron microscopy, grid staining |
Riferimenti
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).
- Sun, T., Wu, X. S., et al. The role of calcium/calmodulin-activated calcineurin in rapid and slow endocytosis at central synapses. J Neurosci. 30 (35), 11838-11847 (2010).
- Wu, X. -. S. S., Lee, S. H., et al. Actin Is Crucial for All Kinetically Distinguishable Forms of Endocytosis at Synapses. Neuron. 92 (5), 1020-1035 (2016).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
- Atluri, P. P., Ryan, T. A. The kinetics of synaptic vesicle reacidification at hippocampal nerve terminals. J Neurosci. 26 (8), 2313-2320 (2006).
- Royle, S. J., Granseth, B., Odermatt, B., Derevier, A., Lagnado, L. Imaging phluorin-based probes at hippocampal synapses. Methods Mol Biol. 457, 293-303 (2008).
- Moulder, K. L., Mennerick, S. Reluctant vesicles contribute to the total readily releasable pool in glutamatergic hippocampal neurons. J Neurosci. 25 (15), 3842-3850 (2005).
- Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptopHluorin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6131-6136 (2005).
- Morris, R. G. Elements of a neurobiological theory of hippocampal function: the role of synaptic plasticity, synaptic tagging and schemas. Eur J Neurosci. 23 (11), 2829-2846 (2006).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Calcium accelerates endocytosis of vSNAREs at hippocampal synapses. Nat Neurosci. 4 (2), 129-136 (2001).
- Balaji, J., Armbruster, M., Ryan, T. A. Calcium control of endocytic capacity at a CNS synapse. J Neurosci. 28 (26), 6742-6749 (2008).
- Ferguson, S. M., Brasnjo, G., et al. A selective activity-dependent requirement for dynamin 1 in synaptic vesicle endocytosis. Science. 316 (5824), 570-574 (2007).
- Baydyuk, M., Wu, X. S., He, L., Wu, L. G. Brain-derived neurotrophic factor inhibits calcium channel activation, exocytosis, and endocytosis at a central nerve terminal. J Neurosci. 35 (11), 4676-4682 (2015).
- Wu, X. S., Zhang, Z., Zhao, W. D., Wang, D., Luo, F., Wu, L. G. Calcineurin is universally involved in vesicle endocytosis at neuronal and nonneuronal secretory cells. Cell Rep. 7 (4), 982-988 (2014).
- Zhang, Z., Wang, D., et al. The SNARE proteins SNAP25 and synaptobrevin are involved in endocytosis at hippocampal synapses. J Neurosci. 33 (21), 9169-9175 (2013).
- Wu, L. -. G. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76 (1), 301-331 (2014).
- Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in SH-SY5Y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis. J Vis Exp. (95), e52267 (2015).
- Shaner, N. C., Lin, M. Z., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
- Leitz, J., Kavalali, E. T. Fast retrieval and autonomous regulation of single spontaneously recycling synaptic vesicles. Elife. 3, e03658 (2014).
- Bisht, K., El Hajj, H., Savage, J. C., Sánchez, M. G., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques. J Vis Exp. (112), e54060 (2016).
- Schikorski, T. Monitoring Synaptic Vesicle Protein Sorting with Enhanced Horseradish Peroxidase in the Electron Microscope. High-Resolution Imaging of Cellular Proteins: Methods and Protocols. , 327-341 (2016).
- Kononenko, N. L., Puchkov, D., et al. Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses. Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).
- Wu, Y., O’Toole, E. T., et al. A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis. eLife. 2014 (3), e01621 (2014).
- Heuser, J. E., Reese, T. S. Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 315-344 (1973).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 499-524 (1973).
- Watanabe, S., Rost, B. R., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
- Watanabe, S., Trimbuch, T., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).
- Sankaranarayanan, S., Atluri, P. P., Ryan, T. A. Actin has a molecular scaffolding, not propulsive, role in presynaptic function. Nat Neurosci. 6 (2), 127-135 (2003).
- Zhu, Y., Xu, J., Heinemann, S. F. Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed by single-vesicle imaging. Neuron. 61 (3), 397-411 (2009).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. A., García-Cánovas, F. Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent. Biochim Biophys Acta. 1038 (1), 85-89 (1990).
- Deák, F., Schoch, S., et al. Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis. Nat Cell Biol. 6 (11), 1102-1108 (2004).
- Clayton, E. L., Evans, G. J. O., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
- Wienisch, M., Klingauf, J. Vesicular proteins exocytosed and subsequently retrieved by compensatory endocytosis are nonidentical. Nat Neurosci. 9 (8), 1019-1027 (2006).
- Fernández-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
- Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins. Nat Commun. 6, 8392 (2015).
- Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin. J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).
- Wisse, E., Braet, F., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Søndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions. J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).
