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Neuroscienze

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

Published: September 04, 2017
doi:
10.3791/55862
, ,
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2College of Pharmacy,Chung-ang University

Summary

Synaptischen Vesikel Endozytose wird durch Lichtmikroskopie pHluorin verschmolzen mit synaptischen Vesikel Protein und Elektronenmikroskopie der Vesikel Aufnahme erkannt.

Abstract

Während der Endozytose sind verschmolzen synaptischen Vesikel Nervenausgänge, zulassend Vesicle recycling und damit die Aufrechterhaltung der synaptischen Übertragung während des Brennens von sich wiederholenden Nerv abrufbar. Beeinträchtigt Endozytose in pathologischen Zuständen führt zu einer Abnahme in der synaptischen Stärke und Gehirn-Funktionen. Hier beschreiben wir Methoden zur Messung der synaptischen Vesikel Endozytose an Säugetieren hippocampal Synapse in neuronalen Kultur. Wir überwachen synaptischen Vesikel Protein Endozytose durch die Verschmelzung einer synaptischen vesikuläre Membranprotein, einschließlich Synaptophysin und VAMP2/Synaptobrevin, mit pHluorin, eine pH-Sensitive grün fluoreszierendes Protein, das erhöht die vesikuläre lumenal Seite seiner Fluoreszenzintensität als der pH-Wert erhöht. Während Exozytose vesikuläre Lumen pH-Wert erhöht, während bei Endozytose vesikuläre Lumen pH wieder angesäuert ist. So zeigt eine Steigerung von pHluorin Fluoreszenzintensität Fusion, während eine Abnahme Endozytose des Proteins gekennzeichnet synaptischen Vesikel anzeigt. Neben der Verwendung der pHluorin-imaging-Methode Endozytose aufnehmen, überwacht wir vesikuläre Membran Endozytose durch Elektronenmikroskopie (EM) Messungen der Meerrettich Peroxidase (HRP) Aufnahme von Vesikeln. Schließlich überwacht wir die Bildung von Nerven terminal Membran Gruben zu verschiedenen Zeitpunkten nach hohen Kalium-induzierte Depolarisation. Der zeitlichen Verlauf des HRP-Aufnahme und Membran-Grube-Bildung zeigt den zeitlichen Verlauf der Endozytose.

Introduction

Neurotransmitter im synaptischen Vesikeln gespeichert und durch Exozytose freigesetzt. Die synaptischen Vesikel Membran Protein sind dann durch Endozytose internalisiert und in die nächste Runde der Exozytose wiederverwendet. Endozytose von synaptischen Vesikel ist wichtig für die Aufrechterhaltung der synaptischen Vesikel Pools und entfernt überstehende Vesikel aus der Plasmamembran. Die pH-Sensitive grün fluoreszierendes Protein-pHluorin, die unter sauren Bedingungen abgeschreckt und dequenched im pH-neutralen, wurde zur Endozytose Zeitmessung Kurse in Zellen1,2,3live. Das pHluorin-Protein ist in der Regel der lumenal Seite der synaptischen Vesikel Proteine, wie Synaptophysin oder VAMP2/Synaptobrevin beigefügt. Im Ruhezustand wird pHluorin in 5,5 pH-Lumen der synaptischen Vesikel abgeschreckt. Fusion der Vesikel an die Plasmamembran macht das vesikuläre Lumen, die extrazelluläre Lösung, wenn der pH-Wert ~ 7.3 beträgt, was zu einem Anstieg in pHluorin Fluoreszenz. Nach Exozytose zerfällt die erhöhte Fluoreszenz durch Endozytose von synaptischen Vesikel Proteine gefolgt von Vesikel Re Versauerung innerhalb dieser wiederhergestellten Vesikel. Obwohl der Zerfall Endozytose und vesikuläre Re Versauerung reflektiert, spiegelt es meist Endozytose, weil Re Versauerung schneller als Endozytose in den meisten Bedingungen1,4. Die Zeitkonstante der Re Versauerung ist 3-4 s oder weniger5,6, die in der Regel als die 10 schneller s oder mehr erforderlich für Vesikel Endozytose4,5. Wenn Experimente erforderlich sind, um erneute Übersäuerung Endozytose unterscheiden, können Säure abschrecken Experimente mit 4-Morpholineethanesulfonic Säure (MES)-Lösung (25 mM) mit einem pH-Wert von 5,5 verwendet werden, um festzustellen, ob die synaptischen Vesikel Proteine abgerufen werden von der Plasmamembran über Endozytose1,3,4. So der pHluorin Fluoreszenz Intensität Anstieg spiegelt ein ausgewogenes Verhältnis von Exo und Endozytose, und die Abnahme nach Nervenstimulation speziell spiegelt Endozytose.

pHluorin Bildgebung verwendet werden, nicht nur um den zeitlichen Verlauf der Endozytose, sondern auch die Größe der synaptischen Vesikel Becken7,8zu messen, und die Wahrscheinlichkeit der evozierten Freisetzung und spontan release9. Viele Faktoren und Proteinen, die bei der Regulierung der Endozytose, wie Kalzium, lösliche NSF-Anlage Protein (SNARE) Rezeptorproteine, Brain-derived neurotrophen factor(BDNF) und Calcineurin wurden mit pHluorin imaging1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. Darüber hinaus Freisetzung von Neurotransmitter nachgewiesen werden konnte, nicht nur primäre Neuronen sondern Neuroblastom-Zellen mit TIRFM17. Vor kurzem wurden pHluorin Varianten, DsRed, mOrange und pHTomato entwickelt, für die Überwachung der gleichzeitige Aufnahmen von mehreren Faktoren in eine einzige Synapse18,19. Beispielsweise wurde pHTomato mit Synaptophysin verschmolzen und mit einem genetisch codierte Kalzium-Anzeige (GCaMP5K) zum Überwachen von präsynaptischen Vesikel Fusion und Ca2 + Zustrom in die postsynaptischen Fach20verwendet. Daher bietet pHluorin angeschlossen an synaptischen Proteine eine nützliche Methode zur Analyse der Beziehung zwischen Endozytose und Exozytose.

EM ist eine andere Methode, die häufig verwendet, um die Endozytose, aufgrund der hohen räumlichen Auflösung zu studieren, die Ultrastrukturforschung Änderungen während der Endozytose zeigt. Zwei allgemeine Bereiche sind die Fähigkeit zu visualisieren, pathologische Veränderungen in Nervenzellen21 und Vesikel Proteine22zu verfolgen. Insbesondere die Beobachtung der synaptischen Vesikel-Aufnahme, Krümmung der Membran beschichtet durch Clathrin in der Periactive Zone und Endosomal Strukturen sind möglich mit EM3,23,24,25 ,26,27,28. Während EM mögliche Artefakte wie Fixiermittel-induzierte Fehlbildungen umfasst Endozytose beeinflussen können, und Datenanalyse ist sehr arbeitsintensiv, die Auflösung bietet eine attraktive Möglichkeit, Zellstruktur zu visualisieren. Fixativ Probleme und die Begrenzung in EM zeitlicher Auflösung können durch hohen Druck Einfrieren, bietet eine schnelle und nicht-chemischen Methode stabilisieren die filigranen Strukturen bei Endozytose27überwunden werden.

Protocol

Hinweis: das folgende Protokoll beschreibt die pHluorin bildgebenden Verfahren und EM Methoden in kultivierten hippocampal Neuronen. pHluorin Monitore synaptischen Vesikel Protein Aufnahme in lebenden Zellen und EM erkennt Aufnahme von synaptischen Vesikel und Ultrastrukturforschung Änderungen. Tierpflege und Verfahren NIH Richtlinien befolgt und waren von der NIH Tier Pflege und Nutzung Ausschuss genehmigt. 1. pHluorin Imaging Hippocampal Neur…

Representative Results

Mit der Lipid-Träger-Methode, SpH hippocampal Neuronen, äußerte ermöglicht die Identifizierung des Boutons (Abbildung 1a). Die elektrische Stimulation von Zellen induziert Exozytose und eine entsprechende Zunahme der Fluoreszenzintensität. Die Zunahme der Fluoreszenz (ΔF) wurde durch die Beendigung des Stimulus (Abbildung 1 b) gestoppt. Die erhöhte Fluoreszenz folgte eine langsame Abnahme durch Endozytose. Bei VAMP2-pHluor…

Discussion

Hier zeigen wir Ihnen zwei Methoden zur Überwachung der synaptischen Vesikel Endozytose. Bei der ersten Methode überwacht wir pHluorin mit einem synaptischen Vesikel Protein in transfizierten Neuronen verschmolzen und anschließend elektrisch stimuliert. Zweitens haben wir EM Bildgebung der HRP-Aufnahme, wie von KCl induziert. Wir haben verschiedene Reize aus zwei Gründen. Zunächst hohe Kalium-Anwendung induziert Depolarisation aller Neuronen in der Kultur. Dies erleichtert EM Prüfung, angesichts der Tatsache, dass …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Yong-Ling Zhu für Synaptophysin-pHluorin2x Konstrukt, und Dr. James E. Rothman für die Bereitstellung von VAMP2-Phluorin. Wir danken Dr. Susan Cheng und Virginia Crocker NINDS Elektronenmikroskopie Anlage für ihre technische Unterstützung und Hilfe. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall Intramural Research Program in den USA und einen Zuschuss aus dem KRIBB Initiative Forschungsprogramm (Koreanisch biomedizinische Wissenschaftler Fellowship Program), Korea Research Institute of unterstützt. Biowissenschaften und Biotechnologie, Republik Korea.

Materials

Lipofectamine LTX with Plus Thermo Fisher 15338-100 Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin
neurobasal medium Thermo Fisher 21103-049 Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use
B27 Thermo Fisher 17504-044 Gradient for neuronal differentiation
Glutamax Thermo Fisher 35050-061 Gradient for neuronal culture
Poly-D-Lysine coated coverslip Neuvitro GG-25-pdl Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin
Trypsin XI from bovine pancrease Sigma T1005 Neuronal culture-digest hippocampal tissues
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma D5025 Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension
pulse stimulator A-M systems model 2100 Apply electrical stimulation
Slotted bath with field stimulation Warner Instruments RC-21BRFS Apply electrical stimulation
stimulus isolation unit Warner Instruments SIU102 Apply electrical stimulation
lubricant Dow corning 111 pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber
AP5 Tocris 3693 Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity
CNQX Tocris 190 Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity
Illuminator Nikon C-HGFI Metal halide light source for pHluorin
EMCCD camera Andor iXon3 pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity
Inverted microscopy Nikon Ti-E Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells
NIS-Elements AR Nikon NIS-Elements Advanced Research Software for imaging acquisition and analysis
Igor Pro WaveMetrics Igor pro Software for imaging analysis and data presentation
imaging chamber Warner Instruments RC21B pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells
poly-l-lysine Sigma P4832 Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times
Horseradish peroxidase(HRP) Sigma P6782 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use
Na cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300 Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N
3,3′-Diaminobenzidine(DAB) Sigma D8001 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use
Hydrogen peroxide solution Sigma H1009 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use
glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16365 Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use
TEM JEOL 200CX Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes
CCD digital camera AMT XR-100 Electron microscopy, capturing images
Lead citrate Leica microsystems 16707235 Electron microscopy, grid staining
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Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (127), e55862, doi:10.3791/55862 (2017).
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