التصوير المقطعي التماسك البصري: التصوير الماوس العقدة الشبكية خلايا في فيفو
Summary
ويصف هذه المخطوطة بروتوكول للتصوير في فيفو الشبكية الماوس مع التصوير المقطعي التماسك الضوئية المجال الطيفي عالية الدقة (SD–أكتوبر). وهو يركز على خلايا الشبكية العقدة (كمبوديا) في منطقة بيريبابيلاري، مع عدة المسح والتحديد الكمي للنهج الموصوفة.
Abstract
التغيرات الهيكلية في الشبكية مظاهر شائعة لأمراض العيون. يتيح التصوير المقطعي التماسك الضوئية (OCT) على تحديد الهوية في فيفو– سريعة ومتكررة، وفي دقة عالية. ويصف هذا البروتوكول تصوير أكتوبر في الشبكية الماوس كأداة قوية لدراسة الأعصاب البصرية (أوبن). نظام أكتوبر بديل يستند إلى قياس التداخل، وغير الغازية للمشترك فحوصات نسيجية بعد الوفاة . يوفر إجراء تقييم سريع ودقيق لسمك الشبكية، مما يتيح إمكانية تعقب التغييرات، مثل ترقق الشبكية أو سماكة. نقدم في عملية التصوير والتحليل مع مثال السطر ماوسديلتاج Opa1. ويقترح ثلاثة أنواع من الأشعة، مع اثنين من الأساليب الكمي: الفرجار القياسية ومحلية الصنع. هذا الأخير الأفضل للاستخدام على الشبكية بيريبابيلاري أثناء مسح شعاعي؛ ويجري أكثر دقة، هو الأفضل لتحليل الهياكل أرق. جميع النهج الموصوفة هنا مصممة لخلايا الشبكية العقدة (كمبوديا) ولكن يمكن تكييفها بسهولة للسكان خلية أخرى. وفي الختام، أكتوبر كفاءة في الماوس طراز فينوتيبينج ولديه القدرة على استخدامها لتقييم موثوق بها من التدخلات العلاجية.
Introduction
أكتوبر هو أداة تشخيصية تسهل دراسة الهياكل الشبكية1، بما في ذلك رأس العصب البصري (أنه). على مر السنين، أصبح مؤشرا يمكن الاعتماد عليها لتطور المرض في البشر2،3، وكذلك في القوارض4،5. ويستخدم قياس التداخل لإنشاء صور مقطعية لطبقات الشبكية في قرار محوري 2 ميكرومتر. الطبقة الأعمق هو الألياف العصبية الشبكية الطبقة (رنفل)، التي تحتوي على محاور عصبية حكومة كمبوديا الملكية، التي تبعتها في طبقة الخلية العقدة (جكل)، يتضمن معظمها هيئات حكومة كمبوديا الملكية. التالية هي طبقة بليكسيفورم الداخلية (IPL)، حيث يجتمع dendrites حكومة كمبوديا الملكية بين القطبين، والأفقي، وأماكريني خلية محاور عصبية. هذه، جنبا إلى جنب مع الخلايا الأفقية، تشكل الطبقة النووية الداخلية (المكتب)، والاتصال بهم نتوءات مع محاور عصبية مستقبله في طبقة بليكسيفورم الخارجي (المناضل). هذا هو متبوعة بالطبقة الخارجية النووية (ONL)، مع الهيئات خلية مستقبله ويتم فصل من طبقة مستقبله بالغشاء الحد الخارجي (OLM)، وتسمى أيضا الجزء الجزء الداخلي/الخارجي (IS/OS) طبقة. وأخيراً، هي آخر طبقات يمكن ملاحظتها في الشبكية الماوس ظهارة صباغ الشبكية (RPE) والمشيميه (ج). رنفل وحدها عادة رقيقة جداً يمكن قياسها في الفئران؛ وهكذا، تحليل رنفل/جكل بدلاً من ذلك هو الأفضل4،5. وثمة إمكانية أخرى هي طبقة معقدة GC، الذي يحتوي على هذا الأخير بالإضافة إلى الشعيرات، يجعلها أكثر سمكا وبالتالي أكثر سهولة لقياس في أكتوبر فحص4. ونتيجة لذلك، يمكن أن توفر OCT ثاقبة الحالة المرضية لشبكية العين، كما هو الحال في أوبنس.
وبدلاً من ذلك، غالباً ما يتم تحليل سمك شبكية الماوس مع الأنسجة بعد الوفاة . ومع ذلك، لا يمكن الكشف عن هذه القيود وجوه التقنية المتصلة بجمع الأنسجة، التثبيت، قطع، وتلطيخ، التركيب، إلخ ومن ثم بعض العيوب، مثل سمك خفية التغييرات،. وأخيراً، نظراً للماوس نفسها لا يمكن اختبارها في الوقت عدة نقاط، عدد الحيوانات كل دراسة إلى حد كبير الزيادات، خلافا لاكتوبر. جميع في كل شيء، غير اختزاع، عالية الاستبانة، إمكانية التكرار، رصد الوقت في الوقت، وسهولة الاستخدام للتكنولوجيا أكتوبر جعله الأسلوب المفضل في دراسات أمراض الشبكية.
وتستخدم نماذج الماوس لتحديد العيوب الجينية وتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء retinopathies6. أوبن شكل من اعتلال الشبكية مع إلحاق أضرار جسيمة بالعصب البصري (على)، الذي يتكون من محاور عصبية حكومة كمبوديا الملكية حوالي 1.2 مليون. يمكن أن تركز على على أوبن أو يمكن أن تكون ثانوية بالنسبة لسائر اضطرابات، فطرية أو لا7، مما أدى إلى فقدان المجال البصري، وفي وقت لاحق، العمى. الصفات المميزة ل OPN فقدان حكومة كمبوديا الملكية وعلى الأضرار، التي يمكن ملاحظتها في أكتوبر البشرية رنفل وجكل رقيق2،3. وفي الوقت نفسه، الفسيولوجيا المرضية ل OPN هو ما زالت غير مفهومة، ومن ثم تظل الحاجة إلى اختبار الماوس شبكية العين.
ويصف هذه المخطوطة التصوير والتحديد الكمي لسمك طبقة الشبكية، باستخدام على سبيل المثال Opa1ديلتاج الماوس سطر8،9، نموذجا من ضمور الألياف البصرية المهيمنة (دعاء)10. لتقييم حكومة كمبوديا الملكية الفيزيولوجيا المرضية، فقد حددت كميتها مسح شعاعي ومستطيلة ومدورة. وقد تم ذلك مع الفرجار القياسية المقدمة من البرنامج أكتوبر أو ماكرو محلية صنع وضعت لبرنامج معالجة صور المفتوحة المصدر. الفرجار القياسية صعوبة في التعامل معها وغالباً أكثر سمكا من رنفل/جكل، بينما الفرجار محلية الصنع سهلة الاستخدام، واستنساخه، وأكثر دقة. يقوم الماكرو قياس لطبقة تم الكشف عنها تلقائياً، في 5 نقاط وفي مواقع ثابتة، على كلا الجانبين من أنه في منطقة بيريبابيلاري. وهدف البروتوكول المقدم وصف أكتوبر اقتناء المسح الضوئي لتحديد المواقع الشبكية، مع تركيز على رجكس.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويوفر النظام OCT، غير الغازية في فيفو التصوير الأسلوب، عالية الاستبانة الأشعة المشتركة section تشبه الشبكية. وهكذا، ميزته الرئيسية هو قدرته على تحليل مفصل، مع فرصة رائعة لتبديل البروتوكولات المطبقة بشكل روتيني إلى البشر لنماذج الماوس.
في مثال Opa1ديلتاج الفئران ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل Inserm، جامعة مونبلييه، فرنسا الشبكية، والاتحاد الوطني أفيوجليس des et Déficients بصريا (اناديف)، “رابطة متلازمة دي ولفرام”، مؤسسة من أجل البحوث ميديكال، مؤسسة دي فرانس، ومختبر للتميز برنامج ابيجينميد.
Materials
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | – | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | – | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | – | – | Elastic band |
| Gauze pads 3"x3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | – | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | – | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0,9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | – | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | – | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
Riferimenti
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. State-of-the-art retinal optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).
- Grenier, J., et al. WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity. Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).
- Zmyslowska, A., et al. Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome. Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).
- Chang, B., et al. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42 (4), 517-525 (2002).
- Mustafa, S., Pandit, L. Approach to diagnosis and management of optic neuropathy. Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).
- Sarzi, E., et al. The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse. Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).
- Sarzi, E., et al. Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy. Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).
- Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., Pagon, R. A., et al. Optic Atrophy Type 1. Gene Reviews. 7 (2007), (2007).
- Lenaers, G., et al. Dominant optic atrophy. Orphanet J Rare Dis. 7 (46), (2012).
- Delettre, C., et al. Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).
- Liu, Y., et al. Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).
