Optisk kohærens tomografi: Imaging mus Retinal Ganglion celler In Vivo
Summary
Dette manuskript beskriver en protokol for i vivo billeddannelse af musen nethinden med høj opløsning spektrale domæne optisk kohærens tomografi (SD-OCT). Det fokuserer på retinal ganglion celler (RGC) i regionen peripapillary, med flere scanning og kvantificere tilgange beskrevet.
Abstract
Strukturelle forandringer i nethinden er almindelige manifestationer af oftalmologiske sygdomme. Optisk kohærens tomografi (OCT) gør det muligt for deres identifikation i vivo— hurtigt, gentagne gange og med en høj opløsning. Denne protokol beskriver OCT imaging i mus nethinden som et kraftfuldt værktøj til at studere optic neuropatier (OPN). OCT-systemet er et interferometri-baseret, ikke-invasiv alternativ til fælles slagtningen histologiske assays. Det giver en hurtig og præcis vurdering af retinale tykkelse, giver mulighed for at spore ændringer, såsom retinal udtynding eller fortykkelse. Vi præsenterer den billedbehandling proces og analyse med eksempel på linjen Opa1delTTAG mus. Tre typer af scanninger er foreslået, med to kvantificering metoder: standard og hjemmelavet calipre. Sidstnævnte er bedst for brug på peripapillary nethinden under radial scanninger; at være mere præcis, er at foretrække, at analysere tyndere strukturer. Alle tilgange beskrevet her er designet til retinal ganglion celler (RGC) men er let at tilpasse til andre cellepopulationer. Afslutningsvis OLT er effektiv i mus model fænotyper og har potentiale til at blive brugt for pålidelig evaluering i terapeutiske indgreb.
Introduction
OCT er et diagnosticeringsværktøj, der letter gennemgangen af retinale strukturer1, herunder synsnerven hoved (ONH). Gennem årene er det blevet en pålidelig indikator for sygdomsprogression i mennesker2,3, samt i gnavere4,5. Det bruger interferometri for at oprette tværsnit billeder af nethinden lag på 2 µm aksial beslutning. Det inderste lag er det retinale nerve fiber lag (RNFL), indeholdende RGC axoner, som er efterfulgt af ganglion cellelag (GCL), der indeholder for det meste RGC organer. Næste er den inderste plexiform lag (IPL), hvor RGC dendritter mødes bipolar, vandret og amacrine celle axoner. Disse sammen med vandrette celler, danne de indre nukleare lag (INL), og deres fremspring forbinde med fotoreceptor axoner i den ydre plexiform lag (OPL). Dette er efterfulgt af den ydre nukleare lag (ger), med fotoreceptor celle organer, og er adskilt fra fotoreceptor laget af den ydre begrænsende membran (OLM), også kaldet den indre segment/ydre segment (IS / OS) lag. Endelig er de sidste observerbare lag i mus nethinden den retinale pigment epitel (ÅV) og årehinden (C). RNFL alene er normalt også tynd skal måles i mus; således er analysere RNFL/GCL i stedet at foretrække4,5. En anden mulighed er GC komplekse lag, der indeholder de sidstnævnte ud over IPL, gør det tykkere og dermed endnu nemmere at måle på OCT scanner4. Derfor, OCT kan give indsigt i de patologiske status af nethinden, såsom i OPNs.
Alternativt, tykkelsen af musen nethinden er ofte analyseres med slagtningen histologi. Dog, denne teknik ansigter begrænsninger med hensyn til væv samling, fiksering, skæring, farvning, montering, etc. derfor nogle defekter, såsom subtile tykkelse ændringer, ikke kan registreres. Endelig, da den samme mus ikke kan testes på flere tid peger, antallet af dyr pr. studere meget stigninger, i modsætning til i OLT ‘s. Alt i alt, ikke-invasiv, høj opløsning, mulighed for gentagelse, tid overvågning i time og brugervenligheden af OCT teknologi gør det den foretrukne metode i retinal sygdom undersøgelser.
Musemodeller bruges til at identificere gendefekter og at belyse molekylære mekanismer bag retinopathies6. OPN er en form for retinopati med betydelige skader på synsnerven (på), som består af cirka 1,2 millioner RGC axoner. OPN kan være fokuseret på ON eller kan være sekundært til andre sygdomme, medfødte eller ikke7, fører til visuelle felt tab og senere, blindhed. Karakteristiske træk ved OPN er RGC tab og på skader, der kan observeres i menneskelige OLT som RNFL og GCL udtynding2,3. I mellemtiden, OPN Patofysiologi er stadig dårligt forstået, og dermed behovet for at teste mus nethinder forbliver.
Dette manuskript beskriver imaging og kvantificering af retinale lagtykkelse, ved hjælp af eksemplet med Opa1delTTAG mus linje8,9, en model af dominerende optic atrofi (DOA)10. For at vurdere RGC Patofysiologi, var radial, rektangulære og ringformede scanninger kvantificeret. Dette blev gjort med standard calipre leveres af OCT software eller med en hjemmelavet makro udviklet til en open source billed oparbejdelse program. Standard calipre er vanskeligt at manipulere og ofte tykkere end RNFL/GCL, mens de hjemmelavede calipre er nem at bruge, reproducere og mere præcis. Makroen udfører en måling for et automatisk detekterede lag, i 5 point og på faste holdninger på begge sider af ONH i peripapillary-regionen. Målet med præsenteres protokollen er at beskrive OCT scan erhvervelse for at angive retinal positionering, med fokus på RGCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT system, en non-invasiv i vivo billeddannelse metode, giver høj opløsning retinal section-lignende scanninger. Herigennem, dens største fordel er dens potentiale for detaljeret analyse, med den vidunderlige mulighed for at omsætte protokoller rutinemæssigt anvendes på mennesker til musemodeller.
I eksemplet af Opa1delTTAG mutant mus resultater SD-okt viste en stigning på RNFL og GC komplekse lagtykkelse, hvilket gav mulighed for yderligere udforskning af …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Inserm, Université Montpellier, nethinden Frankrig, Unionens nationale des Aveugles et Déficients Visuels (UNADEV), Association syndrom de Wolfram, Fondation pour la Recherche Médicale, Fondation de France, og Laboratory of Excellence EpiGenMed program.
Materials
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | – | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | – | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | – | – | Elastic band |
| Gauze pads 3"x3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | – | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | – | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0,9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | – | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | – | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
Riferimenti
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. State-of-the-art retinal optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).
- Grenier, J., et al. WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity. Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).
- Zmyslowska, A., et al. Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome. Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).
- Chang, B., et al. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42 (4), 517-525 (2002).
- Mustafa, S., Pandit, L. Approach to diagnosis and management of optic neuropathy. Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).
- Sarzi, E., et al. The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse. Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).
- Sarzi, E., et al. Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy. Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).
- Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., Pagon, R. A., et al. Optic Atrophy Type 1. Gene Reviews. 7 (2007), (2007).
- Lenaers, G., et al. Dominant optic atrophy. Orphanet J Rare Dis. 7 (46), (2012).
- Delettre, C., et al. Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).
- Liu, Y., et al. Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).
