Tomographie par cohérence optique : Imagerie souris ganglionnaires rétiniennes cellules In Vivo
Summary
Ce manuscrit décrit un protocole pour l’imagerie in vivo de la rétine de souris avec tomographie à cohérence optique haute résolution de domaine spectral (SD-OCT). Il se concentre sur les cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) dans la région péripapillaire, avec plusieurs de numérisation et de quantifier les approches décrites.
Abstract
Des changements structurels dans la rétine sont des manifestations fréquentes de maladies ophtalmiques. Tomographie par cohérence optique (OCT) permet leur identification en vivo— rapidement, répétitive et en haute résolution. Ce protocole décrit l’imagerie OCT dans la rétine de souris comme un outil puissant pour étudier les neuropathies optiques (OPN). Le système OCT est une alternative non invasive, basée sur l’interférométrie à commune analyses histologiques post-mortem . Il fournit une évaluation rapide et précise de l’épaisseur rétinienne, prévoyant la possibilité de suivre les changements, tels que la rétine amincissement ou épaississement. Nous présentons le processus et l’analyse d’imagerie avec l’exemple de la lignée de sourisdelTTAG Opa1. Trois types d’analyses sont proposées, avec deux méthodes de quantification : étriers standards et faits maison. Ce dernier est préférable pour une utilisation sur la rétine péripapillaire lors des balayages radiaux ; être plus précis, est préférable pour l’analyse des structures plus fines. Toutes les approches décrites ici sont conçues pour des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) mais sont facilement adaptables à d’autres populations cellulaires. En conclusion, l’OCT est efficace pour le phénotypage de modèle de souris et a le potentiel d’être utilisé pour l’évaluation fiable des interventions thérapeutiques.
Introduction
OCT est un outil de diagnostic qui facilite l’examen des structures rétiniennes1, y compris la tête du nerf optique (ONH). Au fil des ans, il est devenu un indicateur fiable de la progression de la maladie chez les humains2,3, ainsi que dans les rongeurs4,5. Il utilise l’interférométrie pour créer des images en coupe transversale des couches de la rétiniens avec une résolution axiale de 2 µm. La couche la plus profonde est la fibres nerveuses rétiniennes de couche (CFNR), contenant des axones de la CJR, qui est suivie par la couche de cellules de ganglion (GCL), contenant pour la plupart des corps RGC. Ensuite est la couche plexiforme interne (IPL), confluent de dendrites RGC axones cellules bipolaires, horizontales et amacrines. Ceux-ci, ainsi que les cellules horizontales, forment la couche nucléaire interne (INL), et leurs saillies se connecter avec les axones des photorécepteurs dans la couche plexiforme externe (OPL). Ceci est suivi par la couche nucléaire externe (ONL), avec le corps des cellules photoréceptrices et est séparée de la couche des photorécepteurs de la membrane limitante externe (OLM), également appelée segment segment interne/externe (IS / OS) couche. Enfin, les dernières couches observables dans la rétine de souris sont l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) et la choroïde (C). La CFNR seul est normalement trop mince pour être mesurées chez la souris ; ainsi, analyser la CFNR/GCL est plutôt préférable de4,5. Une autre possibilité est la couche complexe GC, qui contient en plus de l’IPL, rendant plus épais et donc encore plus facile à mesurer sur OCT scanne4. Par conséquent, OCT peut donnent un aperçu de l’état pathologique de la rétine, comme dans les foules.
Par ailleurs, l’épaisseur de la rétine de souris est souvent analysée avec histologie post-mortem . Cependant, cette technique visages limites de prélèvement tissulaire, fixation, coupe, coloration, montage, etc. donc, quelques défauts, tels que les changements subtils d’épaisseur, ne peuvent pas être détectés. Enfin, parce que la même souris ne peuvent pas être testée à temps plusieurs points, le nombre d’animaux par étude grandement augmente, à la différence pour OCT. Dans l’ensemble, la caractère non invasif, haute résolution, possibilité de répétition, suivi de temps en temps et facilité d’utilisation de la technologie OCT rendent la méthode de choix dans les études de la maladie de la rétine.
Modèles de souris sont utilisées pour identifier les défauts de gène et à élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les rétinopathies6. OPN est une forme de rétinopathie avec d’importants dégâts au nerf optique (sur), qui est constitué des axones environ 1,2 millions de RGC. OPN peut se concentrer sur le ON ou peut être secondaire à d’autres troubles, innées ou pas7, conduisant à la perte du champ visuel et plus tard, la cécité. Les traits caractéristiques de l’OPN sont perte RGC et sur les dommages, qui peuvent être observés dans les PTOM humaine que CFNR et GCL amincissement2,3. Pendant ce temps, la physiopathologie de l’OPN est encore mal comprise, et donc la nécessité de tester la rétine de souris reste.
Ce manuscrit décrit l’imagerie et la quantification de l’épaisseur de la couche rétinienne, à l’aide de l’exemple de la Opa1delTTAG souris ligne8,9, un modèle d’atrophie optique dominante (DOA)10. Pour évaluer la physiopathologie de la CJR, balayages radiaux, rectangulaires et annulaires ont été quantifiées. Cela a été fait avec étriers standards fournis par le logiciel OCT ou avec une macro maison mis au point un programme de traitement d’images open source. Les étriers standards sont difficiles à manipuler et souvent plus épais que la CFNR/GCL, tandis que les étriers de maison sont faciles à utiliser, reproductibles et plus précis. La macro effectue une mesure pour une couche automatiquement détectée, en 5 points et à des positions fixes, des deux côtés de l’ONH dans la région péripapillaire. Le protocole présenté vise à décrire l’acquisition scan OCT pour spécifier le positionnement rétinienne, en mettant l’accent sur les CGR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le système de l’OCT, un non invasif en vivo méthode, d’imagerie fournit haute résolution scans rétiniens de cross-transversalement-comme. Ainsi, son principal avantage est la possibilité d’une analyse détaillée, avec l’occasion merveilleuse de transposer les protocoles couramment appliqués aux humains, aux modèles de souris.
Dans l’exemple de Opa1delTTAG souris mutantes, SD-OCT résultats ont montré une augmentation de l’épaisseur de couche c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’Inserm, Université de Montpellier, Retina France, Union nationale des Aveugles et Déficients Visuels (UNADEV), Association Syndrome de Wolfram, Fondation pour la Recherche Médicale, Fondation de France et le laboratoire d’Excellence EpiGenMed programme.
Materials
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | – | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | – | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | – | – | Elastic band |
| Gauze pads 3"x3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | – | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | – | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0,9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | – | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | – | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
Riferimenti
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. State-of-the-art retinal optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).
- Grenier, J., et al. WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity. Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).
- Zmyslowska, A., et al. Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome. Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).
- Chang, B., et al. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42 (4), 517-525 (2002).
- Mustafa, S., Pandit, L. Approach to diagnosis and management of optic neuropathy. Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).
- Sarzi, E., et al. The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse. Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).
- Sarzi, E., et al. Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy. Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).
- Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., Pagon, R. A., et al. Optic Atrophy Type 1. Gene Reviews. 7 (2007), (2007).
- Lenaers, G., et al. Dominant optic atrophy. Orphanet J Rare Dis. 7 (46), (2012).
- Delettre, C., et al. Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).
- Liu, Y., et al. Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).
