טומוגרפיה אופטית קוהרנטית: הדמיה העכבר גנגליון תאים In Vivo
Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול עבור ויוו ההדמיה של הרשתית עכבר עם טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי ברזולוציה גבוהה (SD-אוקטובר). הוא מתמקד תאי גנגליון (מהרשות לשיקום האסיר) באזור peripapillary, עם מספר סריקה וכימות הגישות שתוארו.
Abstract
שינויים מבניים ברשתית הם ביטויים נפוצים במחלות אופטלמולוגיות. טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר) מאפשר את זיהוי ויוו– במהירות, שוב ושוב ו ברזולוציה גבוהה. פרוטוקול זה מתאר הדמיה OCT ברשתית עכבר בתור כלי רב עוצמה כדי ללמוד אופטיים צווארית (OPN). מערכת OCT היא חלופה מבוססת על אינטרפרומטריה, לא פולשנית נפוצות לאחר המוות מבחני היסטולוגית. הוא מספק הערכה מהיר ומדויק של עובי הרשתית, מתן אפשרות לעקוב אחר שינויים, כגון דילול או עיבוי רשתית. אנו מציגים את תהליך וניתוח הדמיה עם הדוגמה של הקו העכברdelTTAG Opa1. שלושה סוגי סריקות מוצעים, עם שתי שיטות כמת: מחוגה סטנדרטי, תוצרת בית. האחרון הוא הטוב ביותר עבור שימוש על הרשתית peripapillary במהלך סריקות רדיאלי; להיות מדויקת יותר, עדיף ניתוח דק יותר מבנים. כל הגישות המתוארות כאן מיועדים תאי גנגליון (מהרשות לשיקום האסיר), אבל הם בקלות לצורכי אוכלוסיות תאים אחרים. לסיכום, OCT הוא יעיל בהעכבר דגם phenotyping ויש לו פוטנציאל לשמש להערכה אמינה של התערבויות טיפוליות.
Introduction
הטה א הוא כלי אבחון המאפשרת הבחינה של מבנים ברשתית1, לרבות ראש עצב הראייה (ONH). השנים זה הפך מחוון מהימן של התקדמות המחלה בני אדם2,3, כמו גם מכרסמים4,5. היא משתמשת אינטרפרומטריה ליצור תמונות חתך של שכבות הרשתית ברזולוציה צירית 2-מיקרומטר. השכבה הפנימית ביותר היא סיב העצב ברשתית השכבה (RNFL), המכיל אקסונים מהרשות לשיקום האסיר, אשר מלווה את השכבה תא גנגליון (שזכתה), המכיל בעיקר מהרשות לשיקום האסיר גופות. הבא הוא plexiform השכבה הפנימית (IPL), שבו מהרשות לשיקום האסיר דנדריטים נפגשים אקסונים תא דו-קוטבי אופקי, אמקרין. אלה, יחד עם תאים אופקיים, טופס גרעיני השכבה הפנימית (להיכנס), וחבר בליטות שלהם עם קולט אור אקסונים בשכבה plexiform החיצונית (OPL). זה ואחריו את הגרעין השכבה החיצונית (גרת), עם הגופים תא קולט אור, מופרדת מן השכבה קולט אור באמצעות הגבלת הממברנה החיצונית (OLM), הנקרא גם על קטע קטע פנימי/חיצוני (IS / OS) שכבה. לבסוף, הרבדים הנצפה האחרון ברשתית העכבר הן את אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) דמית (C). RNFL לבד בדרך כלל דק מדי כדי למדוד עכברים; לכן, מנתחים את RNFL/שזכתה במקום הוא עדיף4,5. אפשרות אחרת היא השכבה מורכבים GC, אשר מכיל שהאחרון בנוסף IPL, מקל עבה ולכן אפילו למדוד ב- OCT סורק4. כתוצאה מכך, OCT יכול לספק תובנה מצב פתולוגי של הרשתית, כמו למשל ב- OPNs.
לחלופין, עובי הרשתית העכבר לעיתים קרובות ניתוח עם היסטולוגיה אחרי המוות . עם זאת, מגבלות פרצופים זו טכניקה הנוגעים אוסף רקמה, קיבוע, חיתוך, מכתים, הרכבה, וכדומה ומכאן, כמה פגמים, כגון שינויים עובי עדין, לא ניתן לאתרם. בסופו של דבר, כי העכבר אותו אין אפשרות לבדוק על כמה זמן נקודות, מספר החיות לאדם ללמוד רבות עולה, בניגוד OCT. בסך הכל, האפשרות הלא-invasiveness, ברזולוציה גבוהה, על החזרה, זמן ניטור בזמן, קלות השימוש של הטכנולוגיה OCT להגיע לשיטת הבחירה בלימודי מחלות רשתית
העכבר מודלים משמשים כדי לזהות פגמים הגן התירי המנגנונים המולקולריים שבבסיס retinopathies6. OPN הוא צורה של רטינופתיה עם נזק משמעותי עצב הראייה (ב), אשר מורכב של-1.2 מיליון אקסונים מהרשות לשיקום האסיר. OPN ניתן התמקדו ON או יכול להיות משני הפרעות, מולדת או לא7, אחרים מובילה לאובדן שדה ראייה, מאוחר יותר, עיוורון. התכונות האופייניות של OPN אובדן מהרשות לשיקום האסיר, על נזק, אשר יכול להיות שנצפו באוקטובר אנושי וגם RNFL שזכתה דליל2,3. בינתיים, הפתופיזיולוגיה של OPN הוא עדיין ממעטים להבין, ומכאן הצורך בדיקת רשתית העכבר נשאר.
כתב יד זה מתאר את הדמיה של כימות של עובי שכבת הרשתית, באמצעות הדוגמה של Opa1delTTAG עכבר קו8,9, דגם של ניוון אופטיים דומיננטי (מא ח)10. כדי להעריך פתופסיולוגיה מהרשות לשיקום האסיר, סריקות רדיאלי, מלבני, טבעתי היו לכמת. זה נעשה עם מחוגה הסטנדרטי שסופק על-ידי התוכנה OCT או עם מאקרו תוצרת בית שפותחו עבור תוכנית עיבוד תמונה פתוח. הרכיבים מאוזנים סטנדרטיים הם קשה לתמרן לעיתים קרובות עבה יותר RNFL/שזכתה, ואילו הרכיבים מאוזנים תוצרת בית קל לשימוש, הדירים מדויקת יותר. המאקרו מבצעת מדידה עבור שכבת זוהה אוטומטית, 5 נקודות ו עמדות קבועות, משני צידי ONH באזור peripapillary. המטרה של פרוטוקול הציג היא לתאר את רכישת סריקה OCT כדי לציין מיקום ברשתית, עם דגש על RGCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת OCT, יישום לא פולשנית ויוו הדמיה שיטה, מספק cross section דמוי הרשתית ברזולוציה גבוהה. לכן, היתרון העיקרי שלו הוא הפוטנציאל לניתוח נתונים היסטוריים, עם הזדמנות נפלאה לבצע חילוף פרוטוקולים באופן שגרתי חלה על בני אדם למודלים העכבר.
בדוגמה של Opa1delTTAG עכברים מוטנטי?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי Inserm אוניברסיטת מונפלייה, צרפת רשתית, האיחוד הלאומי des Aveugles et Fondation Déficients Visuels (UNADEV), אגודת תסמונת דה וולפרם, למזוג לה Médicale רשרש, Fondation דה פראנס, מעבדה של מצוינות תוכנית EpiGenMed.
Materials
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | – | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | – | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | – | – | Elastic band |
| Gauze pads 3"x3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | – | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | – | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0,9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | – | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | – | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
Riferimenti
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. State-of-the-art retinal optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).
- Grenier, J., et al. WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity. Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).
- Zmyslowska, A., et al. Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome. Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).
- Chang, B., et al. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42 (4), 517-525 (2002).
- Mustafa, S., Pandit, L. Approach to diagnosis and management of optic neuropathy. Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).
- Sarzi, E., et al. The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse. Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).
- Sarzi, E., et al. Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy. Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).
- Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., Pagon, R. A., et al. Optic Atrophy Type 1. Gene Reviews. 7 (2007), (2007).
- Lenaers, G., et al. Dominant optic atrophy. Orphanet J Rare Dis. 7 (46), (2012).
- Delettre, C., et al. Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).
- Liu, Y., et al. Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).
