ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी: इमेजिंग माउस रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं में Vivo
Summary
इस पांडुलिपि उच्च संकल्प वर्णक्रमीय डोमेन ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (एसडी-अक्टूबर) के साथ माउस रेटिना की vivo इमेजिंग में के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । यह peripapillary क्षेत्र में रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं (RGC) पर केंद्रित है, कई स्कैनिंग और बढ़ाता दृष्टिकोण के साथ वर्णित है ।
Abstract
रेटिना में संरचनात्मक परिवर्तन नेत्र रोगों के आम अभिव्यक्ति कर रहे हैं । ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (अक्टूबर) vivo मेंउनकी पहचान-तेजी से, दोहराए, और एक उच्च संकल्प पर सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में माउस रेटिना में अक्टूबर इमेजिंग ऑप्टिक न्यूरोपैथी (OPN) का अध्ययन करने के लिए । OCT प्रणाली एक interferometry आधारित, गैर इनवेसिव आम पोस्ट मार्टम ऊतकीय परख के लिए वैकल्पिक है । यह रेटिना की मोटाई का एक तेज और सटीक आकलन प्रदान करता है, संभावना परिवर्तन ट्रैक करने के लिए अनुमति देता है, जैसे रेटिना thinning या और अधिक मोटा होना. हम Opa1delTTAG माउस लाइन के उदाहरण के साथ इमेजिंग प्रक्रिया और विश्लेषण प्रस्तुत करते हैं । तीन प्रकार के स्कैन का प्रस्ताव है, दो ठहराव विधियों के साथ: मानक और घर का बना कैलिपर्स । उत्तरार्द्ध रेडियल स्कैन के दौरान peripapillary रेटिना पर उपयोग के लिए सबसे अच्छा है; अधिक सटीक होने के नाते, पतले संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए बेहतर है । यहां वर्णित सभी दृष्टिकोण रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं (RGC) के लिए डिजाइन किए हैं, लेकिन आसानी से अन्य कोशिका आबादी के लिए अनुकूलनीय हैं. अंत में, अक्टूबर माउस मॉडल phenotyping में कुशल है और क्षमता के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेप के विश्वसनीय मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
Introduction
अक्टूबर एक नैदानिक उपकरण है कि रेटिना संरचनाओं की परीक्षा1, ऑप्टिक तंत्रिका सिर (ONH) सहित, की सुविधा है । वर्षों से यह मनुष्यों में रोग प्रगति के एक भरोसेमंद संकेतक बन गया है2,3, साथ ही साथ में कुतर4,5. यह एक 2-µm अक्षीय संकल्प पर रेटिना परतों के पार अनुभागीय छवियों को बनाने के लिए interferometry का उपयोग करता है । अंतरतम परत रेटिना तंत्रिका फाइबर परत (RNFL), युक्त RGC axons, जो नाड़ीग्रंथि कोशिका परत (GCL), ज्यादातर RGC निकायों युक्त द्वारा पीछा किया जाता है । अगले भीतरी plexiform परत (आईपीएल), जहां RGC dendrites द्विध्रुवी, क्षैतिज, और amacrine सेल axons से मिलने है । ये, क्षैतिज कोशिकाओं के साथ मिलकर, भीतरी परमाणु परत (आईएनएल) के रूप में, और उनकी दखलंदाजी बाहरी plexiform लेयर (OPL) में photoreceptor axons के साथ जुड़ती है । इसके बाद बाहरी परमाणु परत (केव), photoreceptor कोशिका निकायों के साथ, और बाहरी सीमित झिल्ली (OLM) द्वारा photoreceptor परत से अलग किया जाता है, जिसे भीतरी सेगमेंट/बाहरी सेगमेंट (is/OS) परत भी कहा जाता है । अंत में, माउस रेटिना में अंतिम चौकस परतों रेटिना वर्णक उपकला (RPE) और रंजित (सी) हैं. अकेले RNFL आम तौर पर भी चूहों में मापा जा पतली है; इस प्रकार, RNFL/GCL का विश्लेषण करने के बजाय बेहतर है4,5। एक और संभावना GC जटिल परत है, जो आईपीएल के अलावा बाद में शामिल है, यह मोटा है और इस तरह भी आसान को मापने के लिए OCT4स्कैन कर रहा है । नतीजतन, OCT रेटिना की रोग की स्थिति, जैसे OPNs में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।
वैकल्पिक रूप से, माउस रेटिना की मोटाई अक्सर पोस्ट मार्टम प्रोटोकॉल के साथ विश्लेषण किया जाता है । हालांकि, इस तकनीक के चेहरे ऊतक संग्रह, निर्धारण, काटने, धुंधला, बढ़ते, आदि से संबंधित सीमाओं इसलिए, कुछ दोषों, जैसे सूक्ष्म मोटाई परिवर्तन, पता नहीं किया जा सकता । अंत में, क्योंकि एक ही माउस कई समय बिंदुओं पर परीक्षण नहीं किया जा सकता, अध्ययन प्रति पशुओं की संख्या बहुत बढ़ जाती है, OCT के लिए विपरीत । सभी के सभी, गैर इनवेसिव, उच्च संकल्प, पुनरावृत्ति के लिए संभावना है, समय में समय की निगरानी, और अक्टूबर प्रौद्योगिकी के उपयोग में आसानी यह रेटिना रोग अध्ययन में पसंद की विधि बनाते हैं ।
माउस मॉडल जीन दोषों की पहचान करने के लिए और आणविक retinopathies अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट करने के लिए उपयोग किया जाता है6। OPN ऑप्टिक तंत्रिका को पर्याप्त क्षति के साथ रेटिनोपैथी का एक रूप है (पर), जो लगभग १,२००,००० RGC axons से बना है । OPN पर केंद्रित किया जा सकता है या अंय विकारों, अजन्मा या नहीं7के लिए माध्यमिक जा सकता है, दृश्य क्षेत्र हानि और बाद में, अंधापन के लिए अग्रणी । OPN की विशेषता लक्षण RGC नुकसान पर और नुकसान है, जो RNFL और GCL thinning के रूप में मानव OCT में मनाया जा सकता है2,3। इस बीच, OPN के pathophysiology अभी भी खराब समझ है, और इसलिए माउस रेटिना परीक्षण की जरूरत बनी हुई है ।
इस पांडुलिपि इमेजिंग और रेटिना परत मोटाई के ठहराव का वर्णन करता है, Opa1delTTAG माउस लाइन8,9, प्रमुख ऑप्टिक शोष (DOA)10के एक मॉडल के उदाहरण का उपयोग कर । RGC pathophysiology, रेडियल, आयताकार, और कुंडलाकार स्कैन का आकलन करने के लिए मात्रा थे । यह या तो मानक कैलिपर्स OCT सॉफ्टवेयर या एक घर का बना एक खुला स्रोत छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम के लिए विकसित स्थूल के साथ द्वारा प्रदान के साथ किया गया था । मानक कैलिपर्स में हेरफेर करने के लिए मुश्किल है और अक्सर RNFL/GCL से मोटा है, जबकि घर का बना कैलिपर्स उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं, प्रतिलिपि, और अधिक सटीक । मैक्रो peripapillary क्षेत्र में ONH के दोनों किनारों पर, एक स्वचालित रूप से पता लगाए गए परत के लिए, 5 बिंदुओं में और निश्चित स्थिति में, एक माप निष्पादित करता है । प्रस्तुत प्रोटोकॉल का लक्ष्य RGCs पर ध्यान देने के साथ, रेटिना पोजीशनिंग निर्दिष्ट करने के लिए अक्टूबर स्कैन अधिग्रहण का वर्णन है ।
Protocol
प्रायोगिक प्रोटोकॉल द्वारा अनुमोदित किया गया institute नेशनल डे ला संत & #233; एट डे ला सूक्ष्म m & #233;d (Inserm; मोंटेपेल्लियर, फ्रांस), यूरोपीय निर्देशों के अनुरूप है, और नेत्र अनुसंधान में पशुओं के उपयोग के लिए ARVO बयान…
Representative Results
Discussion
अक्टूबर प्रणाली, एक गैर vivo इमेजिंग विधि में इनवेसिव, उच्च संकल्प रेटिना पार अनुभाग की तरह स्कैन प्रदान करता है. इस प्रकार, इसका मुख्य लाभ विस्तृत विश्लेषण के लिए अपनी क्षमता है, अद्भुत प्रोटोकॉल स्था…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम Inserm, विश्विद्यालय मोंटेपेल्लियर, रेटिना फ्रांस, यूनियन नेशनल डेस Aveugles एट Déficients Visuels (UNADEV), एसोसिएशन सिंड्रोम डे Wolfram, स्नेहा डालो ला सूक्ष्म Médicale, शौकीनों डी फ्रांस, और उत्कृष्टता की प्रयोगशाला द्वारा समर्थित किया गया था EpiGenMed कार्यक्रम.
Materials
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | – | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | – | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | – | – | Elastic band |
| Gauze pads 3"x3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | – | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | – | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0,9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | – | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | – | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
Riferimenti
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