Optical Coherence tomografi: Bildebehandling musen Retinal Ganglion celler i Vivo
Summary
Dette manuskriptet beskriver en protokoll for i vivo avbilding av musen netthinnen med høy oppløsning spectral domene optical coherence tomografi (SD-oktober). Det fokuserer på netthinnen ganglieceller (RGC) i peripapillary-regionen, med flere skanning og kvantifisere tilnærminger beskrevet.
Abstract
Strukturelle endringer i netthinnen er vanlige manifestasjoner av ophthalmica sykdommer. Optical coherence tomografi (OCT) gjør deres identifikasjon i vivo-raskt, full av gjentagelser og høy oppløsning. Denne protokollen beskriver OCT imaging i musen netthinnen som kraftig verktøy å studere fiberoptisk neuropathies (OPN). OCT systemet er et interferometry-basert, ikke-invasiv alternativ til vanlig post mortem histologiske analyser. Det gir en rask og nøyaktig vurdering av netthinnen tykkelse, slik at muligheten til å spore endringer, for eksempel netthinnen thinning eller jevning. Vi presenterer bildebehandling prosessen og analyse med eksempel på Opa1delTTAG mus linjen. Tre typer skanninger blir foreslått, to kvantifisering metoder: standard og hjemmelaget calipers. Sistnevnte er best for bruk på peripapillary netthinnen under radial skanner; å være mer presis, anbefales for å analysere tynnere strukturer. Alle tilnærminger beskrevet her er beregnet på netthinnen ganglieceller (RGC), men kan lett tilpasses andre celle populasjoner. Avslutningsvis OCT er effektiv i mus modell phenotyping og kan brukes for pålitelig evaluering av terapeutisk intervensjon.
Introduction
OCT er et diagnostisk verktøy som forenkler behandlingen av netthinnen strukturer1, inkludert synsnerven hodet (ONH). Gjennom årene har det blitt en pålitelig indikator av sykdomsprogresjon i mennesker2,3og Red4,5. Den bruker interferometry for å lage tverrsnitt bilder av netthinnen lag 2-µm aksial oppløsning. Det innerste laget er netthinnen nerve fiber laget (RNFL), som inneholder RGC axons, som er etterfulgt av ganglion celle laget (GCL), som inneholder hovedsakelig RGC organer. Neste er det indre plexiform laget (IPL), der RGC dendrites møtes bipolar, vannrett og amacrine celle axons. Disse, med vannrette celler, utgjør det indre kjernefysiske laget (INL), og deres utstikkende deler koble med photoreceptor axons i ytre plexiform laget (OPL). Dette etterfølges av ytre kjernefysiske laget (bare), med photoreceptor cellen legemer, og er skilt fra det photoreceptor laget av den ytre begrensende membranen (OLM), også kalt den indre segment/ytre segmentet (er / OS) lag. Endelig er de siste observerbare lagene i musen netthinnen netthinnens pigment epitel (RPE) og akkord (C). RNFL alene er normalt for tynn skal måles i mus; analysere RNFL/GCL er derfor i stedet å foretrekke4,5. En annen mulighet er GC komplekse laget, som inneholder den siste i tillegg til IPL, gjør det tykkere og dermed enklere å måle på OCT skanner4. Følgelig kan OCT gi innsikt i patologisk status på netthinnen, som i OPNs.
Tykkelsen på musen netthinnen analyseres også ofte med post mortem histology. Men ikke kan denne teknikken ansikter begrensninger knyttet til vev samling, fiksering, skjæring, flekker, montering, etc. derfor noen feil, for eksempel subtile tykkelse endringer, registreres. Til slutt, fordi den samme musen ikke kan testes på flere tid poeng, antall dyr per studere sterkt øker, i motsetning til OCT. Alle ikke-invasiveness og høy oppløsning, mulighet for gjentakelse, overvåkning, og brukervennlighet av OCT teknologi gjør det metoden for valg i netthinnen sykdom studier.
Musen modeller brukes til å identifisere genet defekter og belyse molekylære mekanismer underliggende retinopathies6. OPN er en form for retinopati med betydelig skade på den optiske nerven (på), som består av ca 1,2 millioner RGC axons. OPN kan være fokusert på på eller være sekundært til andre lidelser, medfødt eller ikke7, fører til tap av visuelle feltet og senere blindhet. Karakteristiske trekk av OPN er RGC tap på skader, som kan observeres i menneskelig OCT som RNFL og GCL tynning2,3. I mellomtiden i Patofysiologien ved OPN er fremdeles dårlig forstått, og dermed behovet for å teste musen Netthinne fortsatt.
Dette manuskriptet beskriver bildebehandling og kvantifisering av netthinnen lagtykkelse, bruker eksemplet med Opa1delTTAG mus linje8,–9, en modell av dominerende fiberoptisk atrofi (DOA)10. For å vurdere RGC patofysiologi, kvantifisert radial, rektangulære og ringformede skanner. Dette ble gjort med standard calipers fra OCT programvaren eller med en hjemmelaget makro utviklet for en åpen kildekode bildebehandling programmet. De standard calipers er vanskelig å manipulere og ofte tykkere enn RNFL/GCL, mens de hjemmelagde calipers er brukervennlig, reproduserbare og mer presis. Makroen utfører et mål for en automatisk oppdages laget, i 5 poeng og faste posisjoner, på begge sider av ONH i regionen peripapillary. Målet med presentert protokollen er å beskrive OCT skanning oppkjøpet for å angi retinal posisjonering, med fokus på RGCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT systemet, en ikke-invasiv i vivo imaging metode gir høy oppløsning retinal section-lignende skanner. Således, dens største fordel er dens potensial for detaljert analyse, med den fantastiske muligheten transponere protokoller rutinemessig brukes på mennesker til musen modeller.
I eksemplet Opa1delTTAG mutant mus resultater SD-oktober viste en økning på RNFL og GC komplekse lagtykkelse, som er tillatt for videre utforskning av DOA patofysiologi<sup class=…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Inserm, Université Montpellier, netthinnen Frankrike, Union National des Aveugles et Déficients Visuels (UNADEV), Association syndrom de Wolfram, Fondation pour la Recherche Médicale, Fondation de France, og Laboratory of Excellence EpiGenMed program.
Materials
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | – | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | – | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | – | – | Elastic band |
| Gauze pads 3"x3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | – | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | – | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0,9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | – | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | – | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
Riferimenti
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. State-of-the-art retinal optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).
- Grenier, J., et al. WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity. Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).
- Zmyslowska, A., et al. Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome. Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).
- Chang, B., et al. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42 (4), 517-525 (2002).
- Mustafa, S., Pandit, L. Approach to diagnosis and management of optic neuropathy. Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).
- Sarzi, E., et al. The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse. Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).
- Sarzi, E., et al. Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy. Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).
- Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., Pagon, R. A., et al. Optic Atrophy Type 1. Gene Reviews. 7 (2007), (2007).
- Lenaers, G., et al. Dominant optic atrophy. Orphanet J Rare Dis. 7 (46), (2012).
- Delettre, C., et al. Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).
- Liu, Y., et al. Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).
