Modeling Neuronal død og Degeneration i musen primære cerebellare granulet neuroner
Summary
Denne protokol beskriver en simpel metode til isolering og dyrkning af primære mus cerebral granulet neuroner (CGNs) fra 6-7 dage gamle hvalpe, effektiv transduktion af CGNs for tab og gevinst på funktion undersøgelser, og modellering NMDA-induceret neuronal excitotoxicity, lav-kalium-induceret celledød, DNA-skader og oxidativt stress ved hjælp af den samme kultur model.
Abstract
Cerebellare granulet neuroner (CGNs) er et almindeligt anvendte neuronal model, danner en rigelige homogen befolkning i lillehjernen. I lyset af deres postnatal udvikling, overflod, og adgangen er CGNs en ideel model til at studere neuronal processer, herunder neuronal udvikling, neuronal migration og fysiologiske neuronal aktivitet stimulation. Derudover giver CGN kulturer en fremragende model for at studere forskellige former for celledød, herunder excitotoxicity og apoptose. Inden for en uge i kultur express CGNs N-methyl-D-aspartat (NMDA) receptorer, en bestemt ionotropic glutamat receptor med mange kritiske funktioner i neuronal sundhed og sygdom. Tilsætning af lave koncentrationer af NMDA sammenholdt med membran depolarisering til gnaver primære CGN kulturer har været brugt til at modellere fysiologiske neuronal aktivitet stimulation, mens tilsætning af høje koncentrationer af NMDA kan være ansat til at modellere excitotoxic neuronal skade. Her beskrives en metode til isolering og dyrkning af CGNs fra 6 dage gamle hvalpe samt genetisk manipulation af CGNs af adenovirus og lentiviruses. Vi også nuværende optimerede protokoller om, hvordan man stimulerer NMDA-induceret excitotoxicity, lav-kalium-induceret apoptose, oxidativ stress og DNA-skader efter transduktion af disse neuroner.
Introduction
Cerebellare granulet neuroner (CGNs) er godt præget i kultur og har tjent som en effektiv model til at studere neuronal død og udvikling 1,2,3,4,5, 6. den tidlige udtryk for N-methyl-D-aspartat (NMDA) receptorer i CGN kulturer i vitro gør dem en attraktiv model til at studere NMDA-induceret signalering. Aktivering af disse receptorer med NMDA sammenholdt med membran depolarisering bruges til at modellere fysiologiske neuronal aktivitet stimulation, og har gjort det muligt for forskning i mekanismer af synaptisk plasticitet 7,8. Tværtimod kan over-stimulation af disse receptorer af NMDA ligand bruges til at modellere excitotoxicity, en vigtig mekanisme af neuronal tabet i akutte skader på hjernen og neurodegenerative sygdomme 9. En mekanisme til induktion af excitotoxicity er gennem ATP sult med reduceret ilt, som ses med akut neuronal skade. Dette fører til membran depolarisering og forhøjede niveauer af glutamat frigive på synapser. Den efterfølgende overstimulering af NMDA-receptor af forhøjede glutamat resulterer i overdreven Ca2 + tilstrømning via disse receptorer, som igen aktiverer flere veje herunder Ca2 +-aktiveret proteaser, phospholipases, og endonucleases, der resulterer i ukontrolleret nedbrydningen af kritiske cellulære komponenter og celledød. Derudover, fører høje intracellulære Ca2 + til generation af ilt frie radikaler og mitokondriel skader 10,11.
Mens fleste af neuronal tab efter NMDA-induceret neuronal excitotoxicity skyldes calcium tilstrømning og er Bax/Bak uafhængige, kan andre mekanismer for celledød udelukkes fra denne model. Udseendet af begge nekrotisk og apoptotisk celledød på grund af excitotoxicity er delvist skabelsen af reaktive ilt arter (ROS) og DNA-skader forårsaget af høje intracellulære Ca2 + niveauer 12. DNA-skader medfører neuronal død gennem apoptotiske mekanismer, at være korreleret med kendetegnene ved apoptotisk celledød, såsom fremkomsten af kromatin masserne og apoptotiske organer. Induktion af apoptose er medieret gennem frigivelse af cytokrom c fra mitokondrier, og har vist sig at være afhængig af Bax/Bak oligomerisering 13. Bax/Bak oligomerisering fremmer pore dannelse i den ydre membran, som resulterer i cytokrom c frigivelse og aktivering af pro-apoptotiske lovgivere som set med mild iskæmisk skade 14.
Generation af ROS er et vigtigt spørgsmål i hjernen på grund af de lave endogene niveauer af antioxidanter, kombineret med store ilt kravet om neuronal fungerende 15. Når de udsættes for en iskæmisk begivenhed, er nitrogenoxid syntase upregulated, producerer nitrogenoxid og øge reaktive ilt arter 14. Den øgede koncentration af ilt radikaler kan forårsage DNA-skader og indirekte forårsage energi sult. Høje niveauer af DNA dobbelt-strenget pauser er afhjulpet ved aktivering af poly ADP-ribose polymerase-1 (PARP-1), en eukaryot kromatin-bundet protein ansvarlig for katalysere overførsel af ADP-ribose enheder fra NAD+, en integreret del af processen DNA reparation 16. Men med alt for store skader på grund af oxidativt stress, PARP-1 aktivering kan forårsage energi sult på grund af den øgede afløb på NAD+, et nødvendigt substrat til produktion af ATP ved oxidativ fosforylering. I sidste ende, oxidativ stress vil udløse apoptose i Bax/Bak afhængig måde fører til mitokondrie cytokrom c release, og har vist sig at fremkalde mitokondrie ombygning i CGNs 17.
Endelig, ændringer i koncentrationen af kaliumchlorid (KCl) i CGN kulturer kan bruges til at modellere lavt kalium/depolarisering medieret apoptose 18,19,20. Når udsat for lave niveauer af K+, gennemgå CGNs forskellige fysiologiske ændringer, hvilket resulterer i reduktion af både mitokondrie respiration og glykolyse, tilskrives nedsat cellulær efterspørgsel 21, samt reduktion i niveauet af nuklear factor-κB (NFκB) som regulerer aktiviteter herunder betændelse og synaptisk transmission 22. Denne model er af særlig interesse for studiet af celledød under neuronal udvikling. Lav K+ miljøet mere nøje ligner fysiologiske tilstande, og forårsager kendetegnende for celledød ses under neuronal udvikling 23.
I Resumé giver CGNs en mangeårige model til at undersøge de underliggende molekylære mekanismer af neuronal død og degeneration. Følgende protokol giver mulighed for isolering og dyrkning af CGNs, udtryk eller undertrykkelse af en bestemt genetisk pathway ved hjælp af vira og induktion af neuronal død via forskellige mekanismer der repræsenterer neuronal skade og degeneration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her giver vi en simpel metode til dyrkning af primære mus cerebellare granulet neuroner (CGNs), tab og gevinst på funktion studier og modellering forskellige ordninger for celledød. Adskillige faktorer påvirker reproducerbarhed af resultaterne ved hjælp af denne procedure, som kræver nøje overvågning. Disse omfatter renheden af den kultur, herunder eliminering af glial celler i kulturen, sammenløbet af kultur, og opretholde sunde celler. At indføre variation i disse faktorer kan bias resultaterne og udfordre re…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er støttet af naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada og den canadiske institutter for sundhedsforskning tilskud til AJ-A.
Materials
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
Riferimenti
- Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
- Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
- Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
- Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
- Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
- Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
- Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
- Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
- Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
- Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
- Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
- Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
- D’Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
- Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
