Modelagem de morte Neuronal e a degeneração no Mouse grânulo cerebelar primária de neurônios
Summary
Este protocolo descreve um método simples para isolar e neurônios de grânulo cerebral principal do rato (CGNs) de filhotes de 6-7 dias de idade, transdução eficiente de CGNs para perda e ganho de estudos de função, de cultivo e modelagem excitotoxicidade neuronal induzida por NMDA, morte celular baixo potássio-induzida, danos ao DNA e estresse oxidativo usando o mesmo modelo de cultura.
Abstract
Neurônios de grânulo cerebelar (CGNs) são um modelo neuronal comumente usado, formando uma população homogénea abundante no cerebelo. Tendo em conta o seu desenvolvimento pós-natal, abundância e acessibilidade, CGNs são um modelo ideal para estudar processos neuronais, incluindo o desenvolvimento neuronal, a migração neuronal e estimulação da atividade neuronal fisiológica. Além disso, culturas CGN fornecem um modelo excelente para estudar os diferentes modos de morte celular, incluindo excitotoxicidade e apoptose. Dentro de uma semana em cultura, CGNs expressar receptores N-metil-D-aspartato (NMDA), um receptor de glutamato de geleificação específicos com muitas funções críticas em saúde neuronal e doença. A adição de baixas concentrações de NMDA em conjunto com a despolarização da membrana para roedores culturas primárias de CGN tem sido usada para estimulação da atividade neuronal fisiológica do modelo enquanto a adição de altas concentrações de NMDA pode ser empregada para modelar excitotoxic lesão neuronal. Aqui, um método de isolamento e cultivo de CGNs de filhotes 6 dias de idade, bem como a manipulação genética de CGNs por adenovírus e lentivírus são descritos. Estamos também presentes protocolos otimizados em como estimular excitotoxicidade induzida por NMDA, baixo potássio-induzida apoptose, stress oxidativo e dano do ADN após transdução destes neurônios.
Introduction
Neurônios de grânulo cerebelar (CGNs) são bem caracterizados em cultura e têm servido como um modelo eficaz para estudar a morte neuronal e desenvolvimento 1,2,3,4,5, 6. a expressão inicial dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA) no CGN culturas em vitro faz-lhes um modelo atraente para estudar induzida por NMDA sinalização. A ativação destes receptores com NMDA em conjunto com a despolarização da membrana é usada para modelar a estimulação da atividade neuronal fisiológica e tem permitido para pesquisa em mecanismos de plasticidade sináptica 7,8. Pelo contrário, excesso de estimulação desses receptores por ligante NMDA pode ser usado para modelar excitotoxicidade, um importante mecanismo de perda neuronal aguda doenças danos cerebrais e neurodegenerativas 9. Um mecanismo para a indução da excitotoxicidade é através da inanição de ATP com oxigênio reduzido, como pode ser visto com lesão neuronal aguda. Isso resulta na despolarização da membrana e liberação de níveis elevados de glutamato em sinapse. A superestimulação subsequente do receptor NMDA pelo glutamato elevado resulta em excessiva Ca2 + influxo através destes receptores, que por sua vez ativa diversos caminhos, incluindo Ca2 +-ativado proteases, fosfolipases, e endonucleases, resultando na degradação descontrolada da críticos componentes celulares e morte celular. Além disso, alta intracelular Ca2 + leva à geração de radicais livres de oxigênio e dano mitocondrial 10,11.
Enquanto a maioria da perda neuronal após excitotoxicidade neuronal induzida por NMDA é devido ao influxo de cálcio e é independente de Bax/Bak, outros mecanismos de morte celular não podem ser excluídos deste modelo. A aparência de ambos necrótico e apoptose morte celular devido a excitotoxicidade é parcialmente devido a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e danos no DNA causados poralta intracelular Ca 2 + níveis 12. Dano do ADN resulta em morte neuronal através de mecanismos de apoptose, sendo correlacionados com marcas da morte de apoptose celular, como o aparecimento de massas de cromatina e corpos apoptotic. Indução da apoptose é mediada através da liberação de citocromo c da mitocôndria e foi mostrada para ser dependente de Bax/Bak oligomerização 13. Bax/Bak oligomerização promove a formação de poros na membrana mitocondrial externa, resultando em citocromo c liberação e ativação de pro-apoptotic reguladores como visto com lesão isquêmica leve 14.
Geração de ROS é uma questão importante no cérebro devido os baixos níveis endógenos de antioxidantes, juntamente com a exigência de oxigênio grande para funcionamento neuronal 15. Quando exposta a um evento isquêmico, óxido nítrico sintase é upregulated, produzir o óxido nítrico e aumento de espécies reativas de oxigênio 14. A maior concentração de radicais de oxigênio pode resultar em danos ao DNA e indiretamente causar fome de energia. Altos níveis de quebras de dupla-hélice do DNA são corrigidos por ativação de poli ADP-ribose polimerase-1 (PARP-1), uma proteína de limite a cromatina eucariótica responsável por catalisar a transferência de unidades de ADP-ribose do NAD+, parte integrante de um processo Reparação de DNA 16. No entanto, com danos excessivos devido ao estresse oxidativo, ativação de PARP-1 pode causar fome de energia devido a drenagem aumentada no NAD+, um substrato necessário para a produção de ATP através da fosforilação oxidativa. Em última análise, estresse oxidativo irá desencadear a apoptose em uma maneira dependente de Bax/Bak levando a liberação c mitocondrial citocromo e foi mostrado para induzir a remodelação mitocondrial em CGNs 17.
Finalmente, mudanças na concentração de cloreto de potássio (KCl) em culturas CGN podem ser usadas para modelar baixo potássio/despolarização mediada por apoptose 18,19,20. Quando expostos a baixos níveis de K+, CGNs passam por mudanças fisiológicas distintas, resultando em reduções de respiração mitocondrial e glicólise, atribuído à diminuição da demanda de celulares 21, bem como a redução dos níveis de nuclear factor-κB (NFκB) que regula as atividades, incluindo a inflamação e a transmissão sináptica 22. Este modelo é de particular interesse para o estudo da morte celular durante o desenvolvimento neuronal. O ambiente de K+ baixo mais de perto se assemelha a condições fisiológicas e provoca marcas da morte celular durante o desenvolvimento neuronal 23.
Em resumo, CGNs fornecer um modelo de longa data para investigar os mecanismos moleculares subjacentes da morte neuronal e degeneração. O seguinte protocolo permitirá isolamento e cultivo de CGNs, expressão ou repressão um percurso genético específico usando o vírus e a indução de morte neuronal através de diferentes mecanismos que representa a degeneração e lesão neuronal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós fornecemos um método simples para o cultivo de neurônios de grânulo cerebelar mouse principal (CGNs), perda e ganho de estudos de função e modelagem de diferentes mecanismos de morte celular. Vários fatores afetam a reprodutibilidade dos resultados usando este procedimento que requerem monitoramento de perto. Estes incluem a pureza da cultura, incluindo a eliminação das células gliais na cultura, a confluência da cultura e manter as células saudáveis. Introdução de variabilidade nesses fatores pod…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado por ciências naturais e engenharia Conselho de pesquisa do Canadá e os institutos canadenses de pesquisa em saúde concede ao AJ-A.
Materials
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
Riferimenti
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