Autophagy रिसर्च में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन
Summary
यहां प्रस्तुत है दो एंटीबॉडी आधारित प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन रिसर्च तकनीक: इम्यूनोफ्लोरेसेंस और immunoprecipitation । इन तकनीकों सेलुलर संकेत रास्ते के उपंयास घटकों की खोज के लिए और प्रोटीन गतिशीलता को समझने के लिए प्रोटीन के बीच शारीरिक बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैं ।
Abstract
प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन सेलुलर संकेत करने वाले कैस्केडिंग को समझने और उपंयास मार्ग घटकों और प्रोटीन गतिशीलता की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । सेलुलर गतिविधियों के बहुमत प्रोटीन के बीच शारीरिक बातचीत की आवश्यकता है । इन इंटरैक्शन का विश्लेषण और मैप करने के लिए, विभिंन प्रायोगिक तकनीकों के साथ ही bioinformatics उपकरण विकसित किए गए थे । Autophagy एक सेलुलर रीसाइक्लिंग तंत्र है कि कोशिकाओं को विभिंन तनाव के साथ सामना करने की अनुमति देता है, पोषक तत्व अभाव, रसायन सहित, और हाइपोक्सिया । आदेश में बेहतर autophagy-संबंधित संकेतन घटनाओं को समझने के लिए और उपंयास कारकों है कि autophagy में प्रोटीन परिसरों को विनियमित खोजने के लिए, हम प्रोटीन प्रोटीन संपर्क स्क्रीन प्रदर्शन किया । इन स्क्रीनिंग परिणामों के सत्यापन इम्यूनोफ्लोरेसेंस और immunoprecipitation तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता है । इस प्रणाली में, विशिष्ट autophagy से संबंधित प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत है कि हम Neuro2A (N2A) और HEK293T सेल लाइनों में परीक्षण किया गया पता चला । तकनीकी प्रक्रियाओं का विवरण इस दृश्य प्रयोग कागज में समझाया जाता है ।
Introduction
Macroautophagy (autophagy, स्पेसिफिकेशंस) एक सेलुलर तनाव तंत्र है कि थोक कोशिका, प्रोटीन की ज़ब्ती की विशेषता है, और डबल झिल्ली बुलबुले में organelles autophagic बुलबुले कहा जाता है । डबल झिल्ली की बाहरी परत के फ्यूजन के माध्यम से, autophagic बुलबुले और उनके माल lysosomes करने के लिए वितरित कर रहे हैं और उसमें नीचा1. Autophagy सभी कोशिका प्रकार में और सभी जीवों में कम बेसल स्तर पर होता है, ऐसे प्रोटीन क्षरण और organelle के रूप में समस्थिति कार्यों का प्रदर्शन (उदा, mitochondria) कारोबार । ऐसे भुखमरी के रूप में सेलुलर तनाव के लिए अग्रणी शर्तों के तहत, autophagy तेजी से विनियमित है और सेल ऊर्जा का स्तर और बुनियादी चयापचय1,2,3बनाए रखने के लिए अनुमति देता है ।
लगभग 30 autophagy जीन खमीर से क्लोन किया गया है और उनके प्रोटीन उत्पादों को autophagic प्रक्रिया के विभिंन चरणों में एक भूमिका निभाते हुए दिखाया गया है, पुटिका nucleation, विस्तार, पुटिका फ्यूजन के लिए देर endosome/lysosome, और कार्गो क्षरण सहित 4 , 5. इन जीनों के बहुमत के Orthologs की पहचान की गई है और विभिंन जीवों में अध्ययन अपने सेलुलर कार्यों के संरक्षण की पुष्टि की6। पिछले दशक में अध्ययन से पता चला कि कई autophagy से संबंधित प्रोटीन परिसरों और प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत मौजूद है और है कि वे एक जटिल और नियंत्रित तरीके से autophagy रास्ते नियंत्रित करते हैं । चौराहों, बैकअप, प्रतिक्रिया, और feedforward तंत्र मौजूद है, और वे अंय संबंधित घटनाओं के साथ autophagy समंवय करने के लिए सेल की अनुमति (जैसे vesicular स्राव, lysosome के रूप में, endosomal छंटाई और परिवहन7, आदि.) एक निष्पक्ष खमीर-दो संकर स्क्रीन में एक चारा के रूप में autophagy प्रोटीन ATG5 का उपयोग कर, (ATG5 एक प्रमुख autophagy प्रोटीन conjugating प्रणाली की तरह E2 में शामिल है कि भुखमरी प्रेरित LC3 में autophagy लिपिड मध्यस्थता), हम पहचान लिया है रिसेप्टर सक्रिय C-कळेनासे 1 (RACK1; GNB2L1) के रूप में एक सशक्त और एक उपंयास autophagy घटक8। महत्वपूर्ण बात, स्क्रीन से पता चला है कि ATG5-RACK1 बातचीत शास्त्रीय autophagy उत्प्रेरण (यानी, भुखमरी और mTOR निषेध) द्वारा autophagy प्रेरण के लिए अपरिहार्य था ।
इम्यूनोफ्लोरेसेंस आधारित तरीकों सामांयतः प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है । इन तकनीकों को मुख्य रूप से एंटीबॉडी आधारित हैं, और बातचीत की कल्पना और सेलुलर स्थानीयकरण की पुष्टि करने में मदद । इस तकनीक में, फ्लोरोसेंट टैग संयुग्मित एंटीबॉडी कि ब्याज की प्रोटीन के लिए विशिष्ट है आम तौर पर विशिष्ट धुंधला के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रत्येक प्रोटीन अलग फ्लोरोसेंट रंगों को युग्मित एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जा सकता है । प्रोटीन-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करना, एक संकेत में ओवरलैप जब छवियों को विलय कर रहे हैं, फोकल माइक्रोस्कोप के तहत प्रोटीन के सह स्थानीयकरण इंगित करता है. तकनीक कोशिकाओं या यहां तक कि ऊतकों के लिए लागू है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक संपर्क गतिशीलता के बारे में सुराग प्रदान करते हैं, और मदद के आकार और प्रोटीन परिसरों के वितरण की पहचान, जबकि सेलुलर आकृति विज्ञान में सामान्य परिवर्तन ट्रैकिंग के तहत9. Immunoprecipitation एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया एंटीबॉडी आधारित तकनीक है कि दिया प्रोटीन के बीच बातचीत के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है10। इस तकनीक का प्रयोग, ब्याज की प्रोटीन कोशिकाओं या ऊतक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर निष्कर्षों से अलग कर रहे हैं, प्रोटीन है कि एक परिसर में या ब्याज की एक प्रोटीन के साथ संपर्क में हैं की वर्षण में जिसके परिणामस्वरूप. सह immunoprecipitation, जहां प्रोटीन और उसके सह-संपर्क का पता चला रहे हैं, दो प्रोटीन के बीच न केवल बातचीत से पता चलता है, लेकिन विभिंन परिस्थितियों के तहत बातचीत की अपनी ताकत उपाय कर सकते है11।
इस प्रोटोकॉल की पुष्टि करें और ATG5-RACK1 और RACK1-LC3 बातचीत की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है कि विस्तार से महत्वपूर्ण तकनीकों में वर्णन करता है । ध्यान इम्यूनोफ्लोरेसेंस और immunoprecipitation तकनीक पर है, महत्वपूर्ण कदम और autophagy अनुसंधान के लिए नुकसान के जोर के साथ, साथ ही समस्या निवारण सुझाव ।
Protocol
1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस HEK293T उच्च ग्लूकोज मध्यम में DMEM मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं को बनाए रखने, और N2A कम ग्लूकोज मध्यम में neuroblast माउस DMEM कोशिकाओं, एक 5% सह में 2 -humidified मशीनी पर ३७ & #176; सी. 10% गर्मी निष्क्रि?…
Representative Results
Discussion
प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए Immunoprecipitation और इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक महत्वपूर्ण हैं । हालांकि इन दो तकनीकों आमतौर पर इस्तेमाल किया और अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं, कई मानदंडों को इन तकनीक?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम तुर्की के वैज्ञानिक और प्रौद्योगिकीय अनुसंधान परिषद (TUBITAK) १००१ अनुदान 107T153, Sabanci विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था । एसईबी और NMK एक TUBITAK BIDEB २२११ पीएच. डी. अध्ययन के लिए छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित हैं ।
Materials
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
Riferimenti
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