الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر من الخلايا العصبية المهاجرة في شريحة عضوي نمط ثقافة الفأر الجنينية باستخدام الدماغ<em> في أوتيرو</em> إليكتروبوراتيون
Summary
يوفر هذا البروتوكول تعليمات للمراقبة المباشرة من الخلايا العصبية القشرية هجرة شعاعيا. في إليكتروبوراتيون الرحم ، يتم دمج ثقافة شريحة عضوي النمط، والوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر لدراسة مباشرة وديناميكية آثار أوفيركسريسيون أو دونريغولاتيون من الجينات التي تهم في الخلايا العصبية المهاجرة وتحليل التمايز أثناء التنمية.
Abstract
في الرحم إليكتروبوراتيون هو نهج سريع وقوي لدراسة عملية الهجرة شعاعي في القشرة المخية لتطوير الأجنة الماوس. وقد ساعدت على وصف مختلف خطوات الهجرة شعاعي وتوصيف الآليات الجزيئية السيطرة على هذه العملية. لتحليل الخلايا العصبية المهاجرة مباشرة وديناميكية يجب أن تعزى على مر الزمن. يصف هذا البروتوكول سير العمل الذي يجمع بين إليكتروبوراتيون الرحم مع ثقافة شريحة عضوي النمط والوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر، والذي يسمح لفحص مباشر وتحليل ديناميكي من الخلايا العصبية القشرية هجرة شعاعيا. وعلاوة على ذلك، توصيف مفصل من الخلايا العصبية المهاجرة، مثل سرعة الهجرة، وملامح السرعة، وكذلك التغيرات التوجه شعاعي، هو ممكن. طريقة يمكن بسهولة أن تتكيف لأداء تحليلات وظيفية من الجينات التي تهم في الخلايا العصبية القشرية تهاجر شعاعيا عن طريق فقدان وكسب وظيفة فضلا عن تجارب الإنقاذ. الوقت الفاصلالتصوير من الخلايا العصبية المهاجرة هو للدولة من بين الفن التقنية التي أنشئت مرة واحدة هو أداة قوية لدراسة تطور القشرة المخية في نماذج الماوس من اضطرابات الهجرة العصبية.
Introduction
القشرة المخية الجديدة هي الموقع الرئيسي للوظائف الإدراكية والعاطفية والحسية. وهو يتألف من ست طبقات أفقية موجهة بالتوازي مع سطح الدماغ. خلال الخلايا السلف التنمية في الجدار الجانبي من تلسينيفالون الظهرية تؤدي إلى الخلايا العصبية الإسقاط التي تهاجر شعاعيا نحو سطح بيال واكتساب هوية طبقة محددة الخلايا العصبية. بعد أن يتم إنشاؤها في المناطق البطين / البطين (ف / سفز) هذه الخلايا العصبية تصبح متعددة الأقطاب عابرة وبطيئة هجرتها. بعد إقامة قصيرة في المنطقة المتوسطة (إيز) أنها تتحول إلى مورفولوجيا القطبين، نعلق على سقالة الدبقية شعاعي، ومواصلة الهجرة شعاعي المنحى في لوحة القشرية (كب). عند الوصول إلى الهدف النهائي إسقاط الخلايا العصبية فصل من العمليات الدبقية شعاعي واكتساب هوية طبقة محددة. الطفرات في الجينات التي تؤثر على خطوات مختلفة من هجرة الخلايا العصبية يمكن أن يسبب تشوه قشري شديد، مثل ليسنسشفويا أو المادة البيضاء تغاير 1 ، 2 .
في الرحم إليكتروبوراتيون هو تقنية سريعة وقوية ل ترانسفيكت الخلايا السلف العصبية في الدماغ النامية من الأجنة القوارض 3 ، 4 . مع هذه التقنية فمن الممكن لضربة قاضية و / أو أوفيركسريس الجينات ذات الاهتمام من أجل دراسة وظائفها في تطوير الخلايا العصبية. وقد ساعدت هذه الطريقة على وجه التحديد لوصف التفاصيل المورفولوجية وتوصيف الآليات الجزيئية لعملية الهجرة شعاعي 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 . الخلايا العصبية المهاجرة شعاعيا تخضع لتغييرات ديناميكية في شكل الخلية، وسرعة الهجرة، وكذلك الاتجاه المهاجرة، والتي تتطلب المراقبة المباشرة والمستمرة مع مرور الوقت. شريحة أورغانوتيبيك كولتووإعادة التصوير الفاصل الزمني متحد البؤر من العقول إليكتروبوراتد تسمح لمراقبة مباشرة الخلايا العصبية المهاجرة مع مرور الوقت. باستخدام هذا النهج مجتمعة، فمن الممكن لتحليل سمات متميزة من الخلايا العصبية المهاجرة التي لا يمكن التحقيق في أقسام الأنسجة الثابتة من العقول إليكتروبوراتد.
طبقنا مؤخرا الفاصل الزمني التصوير متحد البؤر من الخلايا العصبية المهاجرة في شرائح شريحة من العقول إليكتروبوراتد لدراسة دور عامل النسخ B خلية كل / سرطان الغدد الليمفاوية 11A (Bcl11a) خلال التنمية القشرية 10 . يتم التعبير عن Bcl11a في الشباب الخلايا العصبية القشرية المهاجرة واستخدمنا متحولة أليل Bcl11a أليل ( Bcl11a فلوكس ) 11 لدراسة وظائفها. إليكتروبوراتيون من كري ريكومبيناس جنبا إلى جنب مع بروتين الفلورسنت الأخضر (غفب) في الأسلاف القشرية من Bcl11a أدمغة فلوكس / فلوكس سمح لنا لخلق حالة متحولة الفسيفساء، والتي يتم تحوير عدد قليل من الخلايا فقط فيخلاف ذلك البرية من نوع الخلفية. وبهذه الطريقة، كان من الممكن لدراسة وظائف مستقلة الذاتي الخلية من Bcl11a على مستوى الخلية واحدة. وجدنا أن الخلايا العصبية الطافرة Bcl11a عرض سرعة منخفضة، والتحولات في ملامح السرعة، وكذلك تغييرات تشبه العشوائية أثناء هجرتها 10 . في بروتوكول المبين وصفنا سير العمل لنجاح إليكتروبوراتيون وشريحة إعداد الثقافة 12 من أدمغة الماوس، فضلا عن الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر من الثقافات شريحة القشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الهجرة الشعاعية هي عملية رئيسية في تطوير القشرة المخية الجديدة. الطفرات في الجينات التي تؤثر على خطوات مختلفة من هذه العملية يمكن أن يسبب تشوهات قشرية شديدة، بما في ذلك ليسنسيفالي والمادة البيضاء تغاير 1 ، 2 . لقد أظهرنا مؤخرا أن Bcl11a، ا?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جاكلين أندراتسشك، إيلينا ويرل، ساتشي تاكيناكا، وماتياس توبيرر للمساعدة التقنية الممتازة، وكذلك فيكتور تارابكين للمناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل منحة من دويتشه فورسشونغزجيمينشافت إلى سب (بر-2215).
Materials
| isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
| fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
| Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
| fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
| ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| horse serum | Gibco | 26050088 | |
| BME | Gibco | 41010026 | |
| borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
| anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
| fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
| stereo microscope | Leica | M125 | |
| inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
| confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
| hybrid detector | Leica | HyD | |
| objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
| microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
| cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
| microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
| endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminin | Sigma | L2020 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
| sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
| tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
| micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
| glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
Riferimenti
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
- Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscienze. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
- Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).
- Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).
- Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).
- John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9 (2002).
- Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).
- De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
- Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
- Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).
- Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).
- Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, i32-i41 (2009).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-43 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscienze. 305, 86-98 (2015).
