Time-lapse konfokal billeddannelse af migrerende neuroner i organotypisk skive kultur af embryonale mus hjernen ved hjælp af<em> I Utero</em> Elektroporation
Summary
Denne protokol indeholder instruktioner til direkte observation af radialt migrerende kortikale neuroner. I utero- elektroporering, organotypisk skivekultur og time-lapse konfokal billeddannelse kombineres for direkte og dynamisk undersøgelse af virkningerne af overekspression eller nedregulering af gener af interesse for migrerende neuroner og for at analysere deres differentiering under udvikling.
Abstract
I utero elektroporation er en hurtig og kraftfuld tilgang til at studere processen med radial migration i cerebral cortex for at udvikle musembryoer. Det har hjulpet med at beskrive de forskellige trin i radial migration og karakterisere de molekylære mekanismer, der styrer denne proces. Til direkte og dynamisk analyse af migrerende neuroner skal de spores over tid. Denne protokol beskriver en arbejdsgang, der kombinerer i utero- elektroporation med organotypisk skivekultur og time-lapse konfokal billeddannelse, som muliggør en direkte undersøgelse og dynamisk analyse af radialt migrerende corticale neuroner. Desuden er detaljeret karakterisering af migrerende neuroner, såsom migrationshastighed, hastighedsprofiler samt radiale orienteringsændringer mulig. Metoden kan let tilpasses til at udføre funktionelle analyser af gener af interesse i radialt migrerende cortical neuroner ved tab og gevinst for funktion samt redningseksperimenter. TidsforskydningBilleddannelse af migrerende neuroner er en state-of-the-art teknik, der en gang etableret er et kraftigt redskab til at studere udviklingen af cerebral cortex i musemodeller af neuronal migrationsforstyrrelser.
Introduction
Neocortex er hovedstedet for kognitive, følelsesmæssige og sensorimotoriske funktioner. Den består af seks vandrette lag orienteret parallelt med hjernens overflade. Under udvikling fremkommer progenitorceller i lateralvæggen af dorsal telencephalon til fremspringneuroner, som migrerer radialt mod pialoverfladen og erhverver en lagtype-specifik neuronal identitet. Efter at være blevet genereret i de ventrikulære / subventriculære zoner (VZ / SVZ) bliver disse neuroner transient multipolære og sænker deres migration. Efter et kort ophold i mellemzonen (IZ) skifter de til en bipolær morfologi, fastgøres til det radiale glialstillads og fortsætter radialt orienteret migration til den kortikale plade (CP). Efter at have nået deres endelige målprojektion, frigør neuroner fra de radiale glialprocesser og erhverver lagsspecifik identitet. Mutationer i gener, som påvirker forskellige trin i neuronal migration, kan forårsage alvorlig kortikal misdannelse, såsom lissencEphaly eller white matter heterotopia 1 , 2 .
I utero elektroporation er en hurtig og kraftfuld teknik til transfektion af neurale progenitorceller i den udviklende hjerne af gnaverembryoer 3 , 4 . Med denne teknik er det muligt at knockdown og / eller overudtrykke gener af interesse for at studere deres funktioner i udvikling af neuroner. Denne metode har specifikt bidraget til at beskrive de morfologiske detaljer og karakterisere de molekylære mekanismer i processen med radial migration 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Radialt migrerende neuroner undergår dynamiske ændringer i celleform, migrationshastighed samt migreringsretning, som kræver direkte og kontinuerlig observation over tid. Organotypisk skivekultusRe og time-lapse konfokal billeddannelse af elektroporerede hjerner tillader direkte observation af migrerende neuroner over tid. Ved hjælp af denne kombinerede tilgang er det muligt at analysere særskilte egenskaber ved migrerende neuroner, der ikke kan undersøges i faste vævssektioner af elektroporerede hjerner.
Vi har for nylig anvendt konfokal billeddannelse af migrerende neuroner i skivekulturer af elektroporerede hjerner for at studere rollen som transkriptionsfaktor B-celle CLL / lymfom 11a (Bcl11a) under kortikal udvikling 10 . Bcl11a udtrykkes i unge migrerende kortikale neuroner, og vi brugte en betinget mutant Bcl11a allel ( Bcl11a flox ) 11 for at studere sine funktioner. Elektroporation af Cre recombinase sammen med grøn fluorescerende protein (GFP) i kortikale stamceller af Bcl11a flox / flox hjerner tillod os at skabe en mosaik mutant situation, hvor kun få celler muteres i enEllers vildtype baggrund. På denne måde var det muligt at studere celleautonomiske funktioner af Bcl11a på enkeltcellens niveau. Vi fandt, at Bcl11a-mutantneuroner viser reduceret hastighed, forskydninger i deres hastighedsprofiler samt tilfældige orienteringsændringer under deres migration 10 . I den skitserede protokol beskriver vi en arbejdsgang for vellykket elektroporering og skivekulturpræparation 12 af musehjerner, såvel som tidsforskydning af konfokal billeddannelse af kortikale skivekulturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Radial migration er en nøgleproces i neocortex udvikling. Mutationer i gener, der påvirker forskellige trin i denne proces, kan forårsage alvorlige kortikale misdannelser, herunder lissencephaly og white matter heterotopia 1 , 2 . Vi viste for nylig, at Bcl11a, som udtrykkes i unge migrerende kortikale projektionsneuroner, spiller en rolle i radial migration. Vi anvendte tidsforskydning af konfokal billeddannelse af migrerende neuroner i akutte kortikale skiv…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka og Matthias Toberer for fremragende teknisk assistance samt Victor Tarabykin til nyttige diskussioner. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft til SB (BR-2215).
Materials
| isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
| fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
| Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
| fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
| ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| horse serum | Gibco | 26050088 | |
| BME | Gibco | 41010026 | |
| borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
| anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
| fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
| stereo microscope | Leica | M125 | |
| inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
| confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
| hybrid detector | Leica | HyD | |
| objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
| microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
| cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
| microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
| endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminin | Sigma | L2020 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
| sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
| tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
| micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
| glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
Riferimenti
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
- Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscienze. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
- Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).
- Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).
- Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).
- John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9 (2002).
- Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).
- De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
- Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
- Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).
- Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).
- Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, i32-i41 (2009).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-43 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscienze. 305, 86-98 (2015).
