Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van<em> In Utero</em> Elektroporatie
Summary
Dit protocol geeft instructies voor directe observatie van radiaal migrerende corticale neuronen. Bij utero- elektroporatie, organotypische snijcultuur en tijdverlopen confocal beeldvorming worden gecombineerd om de effecten van overexpressie of downregulatie van genen die geïnteresseerd zijn in migrerende neuronen direct en dynamisch te bestuderen en hun differentiatie tijdens de ontwikkeling te analyseren.
Abstract
In utero electroporation is een snelle en krachtige aanpak om het proces van radiale migratie in de hersencortex van het ontwikkelen van muisembryo's te bestuderen. Het heeft geholpen om de verschillende stappen van radiale migratie te beschrijven en de moleculaire mechanismen die dit proces beheersen, te karakteriseren. Om migrerende neuronen direct en dynamisch te analyseren, moeten ze in de loop der tijd worden opgespoord. Dit protocol beschrijft een workflow die combineren in utero- elektroporatie met organotypische snijcultuur en tijdverloop confocal beeldvorming, waarmee een direct onderzoek en dynamische analyse van radiaal migrerende corticale neuronen mogelijk is. Bovendien is gedetailleerde karakterisering van migrerende neuronen, zoals migratiesnelheid, snelprofielen, alsmede radiale oriëntatieveranderingen, mogelijk. De methode kan gemakkelijk worden aangepast om functionele analyses van genen van belang in radiaal migrerende corticale neuronen uit te voeren door verlies en winst van functie, alsmede reddingsexperimenten. Time-lapseBeeldvorming van migrerende neuronen is een state-of-the-art techniek die ooit opgericht is een krachtig instrument om de ontwikkeling van de hersencortex in muismodellen van neuronale migratiestoornissen te bestuderen.
Introduction
De neocortex is de belangrijkste site van cognitieve, emotionele en sensorimotorische functies. Het bestaat uit zes horizontale lagen die parallel zijn aan het oppervlak van de hersenen. Tijdens de ontwikkeling geven stamcellen in de laterale wand van de dorsale telencephalon aanleiding tot projectie-neuronen die radiaal migreren naar het paleoppervlak en een lagertype-specifieke neuronale identiteit verwerven. Na het ontstaan in de ventriculaire / subventriculaire zones (VZ / SVZ) worden deze neuronen transient multipolair en vertragen hun migratie. Na een kort verblijf in de intermediaire zone (IZ) veranderen ze naar een bipolaire morfologie, bevestigen aan het radiale gliale steiger en gaan radiaal georiënteerde migratie in de corticale plaat (CP). Bij het bereiken van hun uiteindelijke doelprojectie ontlopen neuronen van de radiale gliale processen en verwerven ze lagenspecifieke identiteit. Mutaties in genen die verschillende stappen van neuronale migratie beïnvloeden, kunnen ernstige corticale misvorming veroorzaken, zoals lissencEphalie of witte stof heterotopia 1 , 2 .
In utero electroporation is een snelle en krachtige techniek om neurale voorloper cellen te transfecteren in de ontwikkelende hersenen van knaagdier embryo's 3 , 4 . Met deze techniek is het mogelijk om genen van belang te knockdown en / of overexpresseren om hun functies te bestuderen bij het ontwikkelen van neuronen. Deze methode heeft specifiek geholpen om de morfologische details te beschrijven en de moleculaire mechanismen van het radiale migratieproces 5 , 6 , 7 , 8 , 9 te karakteriseren. Radiaal migrerende neuronen ondergaan dynamische veranderingen in celvorm, migratiesnelheid, en migrerende richting, die over de tijd directe en continue observatie vereisen. Organotypische plakcultusRe- en time-lapse confocal beeldvorming van elektroporate hersenen maken het mogelijk om migrerende neuronen direct in de gaten te houden. Met behulp van deze gecombineerde aanpak is het mogelijk om verschillende kenmerken van migrerende neuronen te analyseren die niet in vaste weefselsecties van elektroporate hersenen kunnen worden onderzocht.
We hebben onlangs confocale beeldvorming van migrerende neuronen toegepast in snijculturen van elektroporeerde hersenen, om de rol van de transcriptiefactor B-cel CLL / lymfoom 11a (Bcl11a) tijdens de corticale ontwikkeling 10 te bestuderen. Bcl11a wordt uitgedrukt in jonge migrerende corticale neuronen en we gebruikten een conditional mutant Bcl11a allele ( Bcl11a flox ) 11 om zijn functies te bestuderen. Elektroporatie van Cre recombinase samen met groen fluorescerend eiwit (GFP) in corticale stamvaten van Bcl11a flox / flox hersenen liet ons een mozaïekmutante situatie creëren, waarbij slechts enkele cellen gemuteerd zijn in eenAnders wildtype achtergrond. Op deze manier was het mogelijk om cel-autonome functies van Bcl11a op het enkele celniveau te bestuderen. We vonden dat Bcl11a mutante neuronen een verminderde snelheid laten zien, hun snelheidsprofielen veranderen, evenals willekeurige oriëntatieveranderingen tijdens hun migratie 10 . In het geschetste protocol beschrijven wij een workflow voor succesvolle elektroporatie en slice cultuurvoorbereiding 12 van muishersenen, evenals conflicterende confocal imaging van corticale slice culturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Radiale migratie is een sleutelproces in de ontwikkeling van neocortex. Mutaties in genen die verschillende stappen van dit proces beïnvloeden, kunnen ernstige corticale misvormingen veroorzaken, waaronder lissencephalie en white matter heterotopia 1 , 2 . We hebben onlangs aangetoond dat Bcl11a, die uitgedrukt wordt in jonge migrerende corticale projectie-neuronen, een rol speelt in radiale migratie. Wij gebruiken confocal beeldvorming van migrerende neuronen …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka en Matthias Toberer voor uitstekende technische bijstand, evenals Victor Tarabykin voor nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft aan SB (BR-2215).
Materials
| isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
| fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
| Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
| fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
| ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| horse serum | Gibco | 26050088 | |
| BME | Gibco | 41010026 | |
| borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
| anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
| fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
| stereo microscope | Leica | M125 | |
| inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
| confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
| hybrid detector | Leica | HyD | |
| objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
| microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
| cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
| microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
| endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminin | Sigma | L2020 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
| sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
| tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
| micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
| glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
Riferimenti
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
- Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscienze. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
- Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).
- Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).
- Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).
- John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9 (2002).
- Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).
- De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
- Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
- Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).
- Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).
- Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, i32-i41 (2009).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-43 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscienze. 305, 86-98 (2015).
