Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.
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Articolo metodologico
Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nell'utero l' elettroporazione è un approccio veloce e potente per studiare il processo di migrazione radiale nella corteccia cerebrale degli embrioni di topo di sviluppo. Ha contribuito a descrivere i diversi passi della migrazione radiale e caratterizzare i meccanismi molecolari che controllano questo processo. Per analizzare in modo diretto e dinamico i neuroni migrativi, essi devono essere rintracciati nel tempo. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro che combina in elettroporazione utero con la cultura di fetta organotypica e imaging confocale a tempo intervallo, che consente un esame diretto e un'analisi dinamica dei migratori radiali di neuroni corticali. Inoltre, è possibile la caratterizzazione dettagliata dei neuroni migranti, quali velocità di migrazione, profili di velocità e cambiamenti di orientamento radiale. Il metodo può essere facilmente adattato per eseguire analisi funzionali di geni di interesse per la migrazione radiale dei neuroni corticali mediante perdita e guadagno di funzione, nonché esperimenti di salvataggio. Lasso di tempoL'imaging dei neuroni migratori è una tecnica all'avanguardia che una volta stabilita è un potente strumento per studiare lo sviluppo della corteccia cerebrale nei modelli di mouse dei disturbi della migrazione neuronale.
Introduzione
Il neocortex è il principale sito di funzioni cognitive, emotive e sensoriali. È composto da sei strati orizzontali orientati in parallelo alla superficie del cervello. Durante lo sviluppo, le cellule progenitrici nella parete laterale del telencephalon dorsale danno origine a neuroni di proiezione che migrano radialmente verso la superficie del piolo e acquisiscono un'identità neuronale specifica di tipo strato. Dopo essere stati generati nelle zone ventricolari / subventricolari (VZ / SVZ) questi neuroni diventano temporaneamente multipolari e rallentano la loro migrazione. Dopo un breve periodo di permanenza nella zona intermedia (IZ) si passa alla morfologia ....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato per il benessere degli animali (Regierungspräsidium Tübingen) e sono state eseguite in conformità con la legge tedesca del benessere degli animali e la direttiva UE 2010/63 / UE.
1. In Urolo elettroporazione
- Aghi da microinezione
- Tirare i capillari di vetro borosilicato (diametro esterno: 1,0 mm, diametro interno: 0,58 mm, lunghezza: 100 mm) in aghi di microinezione usando un estrattore a micropipetta con filo di scatola (2,5 mm x 2,5 mm) e il seguente programma: HEAT: 540, PULL : 125, VELOCITY: 20 e DELAY: 140. Determinare il v....
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Risultati
In precedenza, abbiamo mostrato che la delezione genica di Bcl11a da parte dell'utero elettroporzionale compromette la migrazione radiale dei neuroni di proiezione di strato superiore 10 . L'elettroporazione di un vettore plasmidico DNA contenente Cre-IRES-GFP ha eliminato efficacemente Bcl11a nei cervelli condizionati Bcl11a flox / flox 11 . Quando abbiamo analizzato .......
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Discussione
La migrazione radicale è un processo fondamentale nello sviluppo del neocortex. Le mutazioni in geni che influenzano diverse fasi di questo processo possono causare gravi malformazioni corticali, tra cui lissencefalia e della sostanza bianca eterotopia 1, 2. Recentemente abbiamo mostrato che Bcl11a, che si esprime nei giovani neuroni di proiezione corticale migratori, svolge un ruolo nella migrazione radiale. Abbiamo utilizzato l'imaging confocale dei migrat.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka e Matthias Toberer per un'ottima assistenza tecnica, nonché Victor Tarabykin per discussioni utili. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft a SB (BR-2215).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| isoflurano | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| Piastra a 6 pozzetti | Corning | 351146 | |
| Piastra a 12 pozzetti | Corning | 351143 | |
| sutura chirurgica non assorbibile | Ethicon | K890H | 3/8 cerchio, 13 mm, punta conica |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | seghettato, lunghezza: 12 cm |
| forbici fini | Fine Science Tools | 14063-09 | angolato lateralmente, lunghezza: 9 cm |
| Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | carburo di tungsteno, lunghezza: 14 cm |
| pinza a punta fine | Fine Science Tools | 11370-40 | dritto, 11 cm |
| Vannas Tü bingen Forbici a molla | Fine Science Tools | 15005-08 | angolato verso l'alto, |
| pinza ad anello | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3 mm, ID, 2,2 mm, lunghezza: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutammina | Gibco | 25030081 | |
| Penicillina/Streptomicina | Gibco | 15140122 | |
| siero di cavallo | Gibco | ||
| BME | Gibco | 41010026 | |
| capillari in vetro borosilicato | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1,0 OD x 0,58 ID x 100 L mm |
| sistema di anestesia | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| camera di anestesia | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| contenitore del filtro fluorescente | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| agarosio a basso punto di fusione | Invitrogen | 16520100 | |
| microtomo a lama vibrante | Leica | VT1200 S | |
| Stereomicroscopio a fluorescenza | Leica | M205 FA | |
| Microscopio per colture tissutali a fluorescenza invertita | Leica | M125 | |
| microscopio a scansione laser confocale | Rivelatore ibrido Leica | TCS SP5II | |
| Leica | HyD | ||
| , 40x/0,60 NA | di | ||
| Life Imaging Services | Cube, Brick & Scatola | ||
| inserto per colture cellulari | Millipore | PICM0RG50 | |
| microgrinder | Narishige | EG-45 | utilizzare un angolo di 38 gradi per smussare il |
| microiniettore | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofene | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
| maxi kit plasmide senza endotossine | Qiagen | 12362 | |
| verde veloce | Sigma | F7252 | |
| laminina | Sigma | L2020 | |
| poli-L-lisina | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucosio | Sigma | G6152 | |
| cloruro di calcio | Sigma | C7902 | |
| solfato di magnesio | Sigma | M2643 | |
| bicarbonato di sodio | Sigma | S6297 | |
| elettroporatore ad onda quadra | Sonidel | CUY21EDIT | |
| pinzette con elettrodi a disco di platino da 5 mm | Estrattore | per | |
| Sutter Instrument | P-97 | ||
| scatola filamento | Sutter Instrument | FB255B | da 2,5 mm x 2,5 mm |
| VWR | 231-0191 | da 185 mm x 5 mm | |
| World Precision Instruments | da 50 mmFD5040-100 |
Riferimenti
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
- Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuron....
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Ristampe e permessi
