Time-lapse-konfokalbildning av migrerande neuroner i organotypisk skivkultur av embryonalt mushinne<em> I Utero</em> Elektroporation
Summary
Detta protokoll tillhandahåller instruktioner för direkt observation av radiellt migrerande kortikala neuroner. I uteroelektrering , organotypisk skivkultur och tidsförlust konfokal bildbehandling kombineras för att direkt och dynamiskt studera effekterna av överuttryck eller nedreglering av gener av intresse för migrerande neuroner och att analysera deras differentiering under utveckling.
Abstract
I utero elektroporation är ett snabbt och kraftfullt sätt att studera processen för radiell migrering i hjärnbarken för att utveckla musembryon. Det har hjälpt till att beskriva de olika stegen av radiell migration och karakterisera de molekylära mekanismerna som styr denna process. För att direkt och dynamiskt analysera migrerande neuroner måste de spåras över tiden. Detta protokoll beskriver ett arbetsflöde som kombinerar uteroelektroporation med organotypisk skivkultur och tidsförlust konfokal bildbehandling, vilket möjliggör en direkt undersökning och dynamisk analys av radiellt migrerande kortikala nervceller. Vidare är detaljerad karakterisering av migrerande neuroner, såsom migrationshastighet, hastighetsprofiler, samt radial orienteringsändringar möjliga. Metoden kan lätt anpassas för att utföra funktionella analyser av gener av intresse för radiellt migrerande kortikala neuroner genom förlust och förstärkning av funktion samt räddningsexperiment. Time-lapseAvbildning av migrerande neuroner är en toppmodern teknik som en gång etablerad är ett kraftfullt verktyg för att studera utvecklingen av hjärnbarken i musmodeller av neuronal migrationsstörningar.
Introduction
Neocortex är den huvudsakliga platsen för kognitiva, känslomässiga och sensorimotoriska funktioner. Den består av sex horisontella lager orienterade parallellt med hjärnans yta. Under utveckling ger progenitorceller i dorsaltelencephalonens sidovägg upphov till projiceringsneuroner som migrerar radiellt mot pialytan och förvärvar en lagstypsspecifik neuronal identitet. Efter att de har genererats i de ventrikulära / subventrikulära zonerna (VZ / SVZ) blir dessa neuroner övergående multipolära och saktar deras migrering. Efter en kort vistelse i mellansektionen (IZ) växlar de till en bipolär morfologi, fäster vid den radiella glialställningen och fortsätter radiellt orienterad migration i kortikalplattan (CP). När de når sin slutliga målprojektion avlägsnas neuroner från de radiella glialprocesserna och förvärvar lagsspecifik identitet. Mutationer i gener som påverkar olika steg av neuronal migration kan orsaka allvarlig kortikal missbildning, såsom lissencEphaly eller vit substans heterotopia 1 , 2 .
I utero elektroporation är en snabb och kraftfull teknik för att transfektera neurala stamceller i den utvecklande hjärnan av gnagareembryon 3 , 4 . Med denna teknik är det möjligt att knockdown och / eller överuttrycka gener av intresse för att studera sina funktioner för att utveckla neuroner. Denna metod har specifikt hjälpt till att beskriva de morfologiska detaljerna och karaktärisera de molekylära mekanismerna för processen med radiell migration 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Radiellt migrerande neuroner genomgår dynamiska förändringar i cellform, migrationshastighet och migrerande riktning, vilket kräver direkt och kontinuerlig observation över tiden. Organotypisk skivkultuRe och time-lapse konfokal avbildning av elektroporerade hjärnor möjliggör direkt observation av migrerande neuroner över tiden. Genom att använda detta kombinerade tillvägagångssätt är det möjligt att analysera olika egenskaper hos migrerande neuroner som inte kan undersökas i fasta vävnadssektioner av elektroporerade hjärnor.
Vi tillämpade nyligen tidsförlust konfokal bildbehandling av migrerande neuroner i skivkulturer av elektroporerade hjärnor för att studera rollen av transkriptionsfaktorn B-cell CLL / lymfom 11a (Bcl11a) under kortikal utveckling 10 . Bcl11a uttrycks i unga vandrande kortikala neuroner och vi använde en villkorad mutant Bcl11a allelen (Bcl11a flox) 11 för att studera dess funktioner. Elektroporation av Cre rekombinas tillsammans med grönt fluorescerande protein (GFP) i kortikala förfäder av Bcl11a flox / flox hjärnor gjorde det möjligt för oss att skapa en mosaikmutant situation där endast få celler muteras i enAnnars vildtypsbakgrund. På detta sätt var det möjligt att studera cell-autonoma funktioner av Bcl11a vid encellsnivå. Vi fann att Bcl11a-mutantneuroner visar reducerad hastighet, skift i deras hastighetsprofiler, liksom slumpmässiga orienteringsändringar under deras migrering 10 . I det beskrivna protokollet beskriver vi ett arbetsflöde för framgångsrik elektroporering och skivkulturspreparation 12 av mushår, såväl som tidsförlust konfokal bildbehandling av kortikala skivkulturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Radiell migrering är en nyckelprocess i utvecklingen av neocortex. Mutationer i gener som påverkar olika steg i denna process kan orsaka allvarliga kortikala missbildningar, inklusive lissensfali och vit substans heterotopi 1 , 2 . Vi visade nyligen att Bcl11a, som uttrycks i unga migrerande kortikala projektionsneuroner, spelar en roll i radiell migration. Vi använde tidsförlust konfokal avbildning av migrerande neuroner i akuta kortikala skivor av elektrop…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka och Matthias Toberer för utmärkt tekniskt bistånd, liksom Victor Tarabykin för användbara diskussioner. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft till SB (BR-2215).
Materials
| isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
| fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
| Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
| fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
| ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| horse serum | Gibco | 26050088 | |
| BME | Gibco | 41010026 | |
| borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
| anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
| fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
| stereo microscope | Leica | M125 | |
| inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
| confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
| hybrid detector | Leica | HyD | |
| objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
| microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
| cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
| microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
| endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminin | Sigma | L2020 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
| sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
| tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
| micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
| glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
Riferimenti
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
- Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscienze. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
- Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).
- Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).
- Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).
- John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9 (2002).
- Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).
- De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
- Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
- Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).
- Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).
- Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, i32-i41 (2009).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-43 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscienze. 305, 86-98 (2015).
