Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em> En Utero</em> Electroporación
Summary
Este protocolo proporciona instrucciones para la observación directa de neuronas corticales que migran radialmente. La electroporación in utero , el cultivo de corte organotípico y la formación de imágenes confocales en intervalos de tiempo se combinan para estudiar directa y dinámicamente los efectos de la sobreexpresión o regulación negativa de genes de interés en las neuronas que migran y para analizar su diferenciación durante el desarrollo.
Abstract
La electroporación in utero es un enfoque rápido y poderoso para estudiar el proceso de migración radial en la corteza cerebral de los embriones de ratón en desarrollo. Ha ayudado a describir los diferentes pasos de la migración radial y caracterizar los mecanismos moleculares que controlan este proceso. Para analizar directa y dinámicamente las neuronas migratorias tienen que ser rastreadas con el tiempo. Este protocolo describe un flujo de trabajo que combina la electroporación in utero con cultivo de corte organotípico y confocal de tiempo transcurrido, lo que permite un examen directo y análisis dinámico de las neuronas corticales que migran radialmente. Además, es posible la caracterización detallada de las neuronas migratorias, como la velocidad de migración, los perfiles de velocidad, así como los cambios de orientación radial. El método puede adaptarse fácilmente para realizar análisis funcionales de genes de interés en neuronas corticales de migración radial por pérdida y ganancia de función así como experimentos de rescate. Lapso de tiempoLa formación de imágenes de las neuronas migratorias es una técnica del estado de la técnica que una vez establecida es una potente herramienta para estudiar el desarrollo de la corteza cerebral en modelos de ratón de trastornos de migración neuronal.
Introduction
El neocórtex es el sitio principal de funciones cognitivas, emocionales y sensoriomotoras. Se compone de seis capas horizontales orientadas en paralelo a la superficie del cerebro. Durante el desarrollo, las células progenitoras en la pared lateral del telencéfalo dorsal dan lugar a neuronas de proyección que migran radialmente hacia la superficie pial y adquieren una identidad neuronal específica del tipo de capa. Después de ser generadas en las zonas ventriculares / subventriculares (VZ / SVZ) estas neuronas se vuelven transitoriamente multipolar y retardan su migración. Después de una corta estancia en la zona intermedia (IZ) cambian a una morfología bipolar, se adhieren al andamio glial radial, y continúan la migración orientada radialmente hacia la placa cortical (CP). Al alcanzar su objetivo final, las neuronas se separan de los procesos radiales de la glía y adquieren una identidad específica de la capa. Las mutaciones en los genes que afectan a diferentes etapas de la migración neuronal pueden causar malformaciones corticales graves, tales como lissencEferencia o heterotopía de la materia blanca 1 , 2 .
La electroporación in utero es una técnica rápida y potente para transfectar células progenitoras neurales en el cerebro en desarrollo de embriones de roedores 3 , 4 . Con esta técnica es posible desmontar y / o sobreexpresar genes de interés con el fin de estudiar sus funciones en el desarrollo de neuronas. Este método ha ayudado específicamente a describir los detalles morfológicos y caracterizar los mecanismos moleculares del proceso de migración radial 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Las neuronas que migran radialmente experimentan cambios dinámicos en la forma celular, velocidad de migración, así como la dirección migratoria, que requieren observación directa y continua a lo largo del tiempo. Organotypic slice cultuRe y time-lapse imágenes confocales de cerebros electroporados permiten observar directamente las neuronas migratorias con el tiempo. Utilizando este enfoque combinado, es posible analizar características distintas de las neuronas migratorias que no pueden ser investigadas en secciones de tejido fijas de cerebros electroporados.
Recientemente hemos aplicado imágenes confocales de lapso de tiempo de migración de neuronas en cultivos de rebanada de cerebro electroporado para estudiar el papel de la CL de células de factor B de transcripción / linfoma 11a (Bcl11a) durante el desarrollo cortical 10 . Bcl11a se expresa en jóvenes neuronas corticales migratorias y se utilizó un alelo condicional Bcl11a ( Bcl11a flox ) 11 para estudiar sus funciones. La electroporación de la recombinasa Cre junto con la proteína fluorescente verde (GFP) en los progenitores corticales de los cerebros flox / flox Bcl11a nos permitió crear una situación de mutante de mosaico, en la que sólo unas pocas células se mutan en unaDe lo contrario de tipo salvaje de fondo. De esta manera, fue posible estudiar las funciones autónomas de células de Bcl11a en el nivel de célula única. Hemos encontrado que Bcl11a mutante neuronas muestran velocidad reducida, cambios en sus perfiles de velocidad, así como al azar-como orientación cambios durante su migración [ 10] . En el protocolo descrito describimos un flujo de trabajo para la electroporación exitosa y la preparación del cultivo en rebanadas 12 de cerebros de ratón, así como imágenes confocales en intervalos de tiempo de cultivos de corte cortical.
Protocol
Representative Results
Discussion
La migración radial es un proceso clave en el desarrollo del neocórtex. Mutaciones en los genes que afectan a diferentes etapas de este proceso puede causar graves malformaciones corticales, incluida la lissencefalia y la materia blanca heterotopia [ 1 , 2] . Recientemente demostró que Bcl11a, que se expresa en jóvenes neuronas de proyección cortical migratorias, desempeña un papel en la migración radial. Utilizamos imágenes confocales de lapso de tiempo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka y Matthias Toberer por su excelente asistencia técnica, así como a Victor Tarabykin por sus útiles discusiones. Este trabajo fue apoyado por una concesión de la Deutsche Forschungsgemeinschaft a SB (BR-2215).
Materials
| isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
| fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
| Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
| fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
| ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| horse serum | Gibco | 26050088 | |
| BME | Gibco | 41010026 | |
| borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
| anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
| fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
| stereo microscope | Leica | M125 | |
| inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
| confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
| hybrid detector | Leica | HyD | |
| objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
| microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
| cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
| microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
| endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminin | Sigma | L2020 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
| sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
| tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
| micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
| glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
Riferimenti
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